Algunos rizobios van armados para luchar contra otras bacterias y para interaccionar con leguminosas

Los rizobios son bacterias del suelo que pueden interaccionar con leguminosas específicas y multiplicarse en estructuras radiculares especializadas llamadas nódulos. En los nódulos las bacterias realizan la fijación biológica de nitrógeno proporcionando una ventaja a estas plantas para crecer en medios pobres en nitrógeno. La relación entre los rizobios y las leguminosas es específica y está mediada por diferentes señales químicas intercambiadas entre los actores. Una de esas señales son proteínas llamadas efectores, que secretan las bacterias al citoplasma vegetal. Se han descritos diferentes sistemas de secreción y uno de ellos se denomina sistema de secreción tipo VI (T6SS). Los T6SS actúan como nanopistolas y pueden disparar efectores que pueden matar a otras bacterias. Este trabajo presenta la importancia del T6SS de Rhizobiumetli Mim1, en la simbiosis con judías, leucenas y mimosas y frente a otras bacterias

Optimizing Gateway™ technology (Invitrogen) to construct Rhizobium leguminosarum deletion mutants

The study of the role of different genes in Rhizobium leguminosarum requires the generation of mutants by homologous recombination. In this communication we describe a novel approach to obtain deletion mutants of genes in Rhizobium using Gateway TM Cloning technology (Invitrogen) and a new vector (pK18-attR), both conjugative and Rhizobium specific, that carries the recombination tails of Gateway system. This tool is a new alternative to the classic approach based on cloning using restriction enzymes. The first step consists of designing directed oligonucleotides with specific tails for isolating recombination fragments and a resistance marker cassette to an antibiotic by PCR. The three inserts are cloned by homologous recombination in three specific vectors, in a single step. The last step consists of multisite-directed recombination of the three donor vectors to the pK18-attR destination vector. After recombination, this vector loses the ccdB gene, whose expression results in synthesis of a DNA gyrase that is lethal to carrier cells and thus guarantees the effectiveness in obtaining clones that carry the homologous construction to the subsequent recombination in Rhizobiu

Caracterización de sistemas de secreción tipo VI en la simbiosis Rhizobium-Leguminosa

El análisis de los genomas de cepas de Bradyrhizobium sp. aisladas de Lupinus mariaejosephae, L. angustifolius y Retama sphaerocarpa, así como de cepas de Rhizobium aisladas de Mimosa affinis y Phaseolus vulgaris, ha permitido identificar la presencia de sistemas de secreción tipo VI de proteínas (T6SS). Los T6SS están implicados en la interacción planta-bacteria mediante el transporte de proteínas efectoras al citoplasma de células vegetales a través de una estructura similar a una nanojeringa de bacteriófago. El análisis se centra en las cepas Bradyrhizobium sp. ISLU101, aislada de L. angustifolius y Rhizobium etli Mim1 aislada de M. affinis, capaz de nodular judías. Mim1 e ISLU101 contienen uno y dos T6SS, respectivamente. Una característica distintiva de los T6SS activos es que las proteínas Hcp y VgrG, que forman parte de la nanojeringa, pueden secretarse al medio extracelular; así para determinar cuando son activos los T6SS identificados, se están realizando inmunoensayos

Endangered Lupinus mariae-josephae species: conservation efforts

A lupin endemism, Lupinus mariae-josephae (Lmj), singularly has been identified in the Valencia province, in Eastern Spain. This lupin thrives in alkaline-limed soils with high pH, a unique habitat for lupins, from a small area in Valencia region. In these soils, Lmj grows in just a few small, defined patches, and previous conservation efforts directed towards controlled plant reproduction have been unsuccessful. This lupin was thought to be extinct in Valencia until 2007, when it was discovered in a limestone patch. The reasons behind Lmj endangered status are presently unknown. This study will focus on the symbiosis between Lmj and rhizobia, and how this relationship might impact the population size of Lmj. We have previously shown that Lmj plants establish a specific root nodule symbiosis with bradyrhizobia present in those soils, and we reasoned that the paucity of these bacteria in soils might contribute to the lack of success in reproducing plants for conservation purposes

Symbiosis of the endangered Lupinus mariae-josephae lupin especies: Successful "in situ" propagation with rhizobial inoculation

Region, in Eastern Spain. This lupine thrives in alkaline soils with high pH, a unique habitat for lupines. In these soils, Lmj grows in just a few defined patches, and previous conservation efforts directed towards controlled plant reproduction have been unsuccessful. A legislative decree (70/2009, page 20156 Anex I) published in the el 'Diario Oficial de la Comunitat Valenciana' shows Lmj in a category corresponding, in the latest version of the Red List of IUCN (IUCN, 2012) (International Union for Conservation of Nature and Nature Resources), to an ?Endangered? legume species not extinct in the wild. Most current IUCN criteria used to define rare, small-range legume species, are based on history of reproductive traits such as number of pods and seeds. We have previously shown that Lmj plants establish a specific root nodule symbiosis with bradyrhizobia present in those soils, and we reasoned that the paucity of these bacteria in soils might contribute to the lack of success in reproducing plants for conservation purposes. Greenhouse experiments using Lmj trap-plants showed an absence, or very low concentration, of Lmj-nodulating bacteria in ?terra rossa? soils of Valencia outside of Lmj plant patches. No Lmj endosymbiotic bacteria were found in ?terra rossa? or alkaline red soils outside the Valencia Lmj endemism region in the Iberian Peninsula or Balearic Islands. Among the rhizobia able to establish an efficient symbiosis with L. mariae-josephae plants, two Bradyrhizobium sp. strains, LmjC and LmjM3, were selected as inocula for seed coating. Two planting experiments were carried out in consecutive years under natural conditions in areas with edapho-climatic characteristics identical to those sustaining natural Lmj populations, and successful reproduction of the plant was achieved. Interestingly, the successful reproductive cycle was absolutely dependent on seedling inoculation with effective bradyrhizobia, and optimal performance was observed in plants inoculated with LmjC, a strain that had previously shown the most efficient behavior under controlled conditions. These results define conditions for L. mariae-josephae conservation and for extension to alkaline-limed soil habitats, where no other known lupine can thrive. Broadly speaking, the work singularly identified the rhizobial symbiosis as a factor affecting the conservation of legumes and often being exceedingly vulnerable to threats. Our results also indicate that seed inoculation with N2-fixing, efficient Rhizobium strains is a strategy to consider in the conservation of endangered legume specie

Presencia de sistemas de secreción de patógenos en bacterias endosimbióticas aisladas de Lupinus de la península Ibérica

Los rizobios son bacterias endosimbióticas capaces de fijar nitrógeno en estructuras especializadas de leguminosas. Esta simbiosis es altamente específica y depende, entre otros factores, de la capacidad de los rizobios de secretar proteínas efectoras a las células vegetales. Se han descrito diferentes sistemas de secreción en patógenos animales y vegetales y posteriormente también se han encontrado en algunos rizobios. En este trabajo se presenta el estudio de varios sistemas de secreción identificados en dos cepas LmjC e ISLU101 aisladas de Lupinus marie-josephae y Lupinus angustifolius respectivamente. LmjC posee un sistema de secreción tipo III formado por agrupación de 33 genes cuya expresión dependería del activador transcripcional TtsI mediado a su vez por flavonoides secretados por la planta huésped. La cepa ISLU101 tiene dos sistemas de tipo VI de 19 y 16 genes cada uno. La importancia en la simbiosis de estos sistemas se está estudiando en estos momentos

Caracterización de bacterias endosimbióticas de Cytisus triflorus, una leguminosa útil para la restauración de suelos en el norte de África

La restauración de suelos degradados y pobres del norte de África puede producirse gracias al crecimiento espontáneo de leguminosas arbustivas como Cytisus triflorus L¿Herit. Parte del éxito de esta planta se debe a que es capaz de formar nódulos en sus raíces ocupados por bacterias denominadas rizobios que aportan dinitrógeno atmosférico fijado a la planta a cambio de fotosintatos. En este trabajo se presenta la caracterización de 37 rizobios aislados de C. triflorus en el norte de Argelia. Se indica morfología y color de las colonias, tiempo de generación, capacidad de nodulación con distintas plantas hospedadoras y tipos de nódulos que forman

Análisis comparativo de bradyrhizobia aislados de Lupinus angustifolius y Lupinus mariae-josephi.

Los altramuces (Lupinus sp.) son leguminosas con alto contenido proteico y alto valor en alimentación animal. Todas las especies de Lupinus que crecen en la Península Ibérica, incluida L. angustifolius, requieren suelos ácidos, excepto L- mariae-josephi, una especie recientemente descrita, que excepcíonalmente crece en suelos alcalinos. Se han analizado las relaciones filogenéticas entre bacterias endosimbióticas (rizobios) de L. mariae-josephi y de L. angustifolius y su posición evolutiva respecto a rizobios aislados de otras especies de Lupinus y de otras leguminosas. Con este fin se comparó la secuencia aminoacídica de proteínas esenciales ("housekeeping"), RecA, AtpD, Glnl l, y de la proteína simbiótica NodC, así como también la secuencia nucleotídica intergénica 16S-23S (ITS). La caracterización simbiótica de L. angustifolius y L. mariae-josephi implicó la realización de ensayos de inoculación cruzada, empleando plantas cuyos endosimbiontes están filogenéticamente próximos. Además, se estudió por microscopía de fluorescencia la distribución de bacteroides en los nodulos, utilizando rizobios que expresan GFP. Se espera identificar factores de la simbiosis con rizobios que capacitan a L .mariae-josephi para crecer en suelos básicos

Caracterización simbiótica y filogenética de rizobios que nodulan la nueva especie Lupinus mariae-josephi

Una nueva especie de altramuz, Lupinus mariae-josephi, ha sido identificado recientemente en Valencia (Pascual, H.). Esta especie, a diferencia de las descritas en la Península ibérica y en el viejo mundo, no crece en suelos ácidos sino en suelos alcalinos y con alto contenido en calcio. El objetivo general de este proyecto es investigar si existen diferencias fenotípicas y genéticas entre los rizobios que nodulan Lupinus mariae-josephi y lupinos de suelos ácidos nativos de la Península Ibérica (Lupinus angustifolius, L.luteus y otras cuatro especies). En este proyecto se han aislado bacterias (rizobios) de nódulos de L. maria-josephi a partir de suelos básicos de Valencia (localidad de LLombai) y se está realizando su caracterización a nivel morfológico, nutricional, simbiótico y molecular. A nivel molecular se han comparado los genes “housekeeping” 16S rRNA, recA, atpD, gln2 y el simbiótico, nodC de diversas cepas que nodulan L. mariae-josephi y con cepas de otras especies de rizobios. Por otra parte, también se está evaluando la capacidad de L. mariae-josephi de ser nodulada por diferentes rizobios bajo condiciones bacteriológicamente controladas

Lupinus mariae-josphi, a new lupin endemic of soils with active lime and high pH in South Eastern Spain, is nodulated by a new bacterial lineage within Bradyrhizobium genus

Lupinus mariae-josephi is a recently described species (Pascual, 2004) able to grow in soils with high pH and active lime content in the Valencia province (Spain). L. mariae-josephi endosymbionts are extremely slowgrowing bacteria with genetic and symbiotic characteristics that differentiate them from Bradyrhizobium strains nodulating Lupinus spp. native of the Iberian Peninsula and adapted to grow in acid soils. Cross-inoculation experiments revealed that all the endosymbiotic isolates from L. mariae-josephi tested are legume-host selective and are unable to nodulate species such as L. angustifolius, and L. luteus. In contrast, Bradyrhizobium strains from Lupinus spp. tested were able to nodulate L. mariae-josephi, although the nodules fixed nitrogen inefficiently. Phylogenetic analysis was performed with housekeeping genes (rrn, glnII, recA, atpD) and nodulation gene nodC. Housekeeping gene phylogeny revealed that L. mariae-josephi rhizobia form a strongly supported monophyletic group within Bradyrhizobium genus. This cluster also includes B. jicamae and certain strains of B. elkanii. Contrarily, isolates from other Lupinus spp. native of the Iberian Peninsula were grouped mainly within B. canariense and two B. japonicum lineages. Phylogenetic analysis of L. mariae-josephi isolates based on the nodC symbiotic gene defined a solid clade close to isolates from Algerian Retama spp. and to fast-growing rhizobia