Una nueva especie de altramuz, Lupinus mariae-josephi, ha sido identificado recientemente en Valencia (Pascual, H.). Esta especie, a diferencia de las descritas en la Península ibérica y en el viejo mundo, no crece en suelos ácidos sino en suelos alcalinos y con alto contenido en calcio. El objetivo general de este proyecto es investigar si existen diferencias fenotípicas y genéticas entre los rizobios que nodulan Lupinus mariae-josephi y lupinos de suelos ácidos nativos de la Península Ibérica (Lupinus angustifolius, L.luteus y otras cuatro especies). En este proyecto se han aislado bacterias (rizobios) de nódulos de L. maria-josephi a partir de suelos básicos de Valencia (localidad de LLombai) y se está realizando su caracterización a nivel morfológico, nutricional, simbiótico y molecular. A nivel molecular se han comparado los genes “housekeeping” 16S rRNA, recA, atpD, gln2 y el simbiótico, nodC de diversas cepas que nodulan L. mariae-josephi y con cepas de otras especies de rizobios. Por otra parte, también se está evaluando la capacidad de L. mariae-josephi de ser nodulada por diferentes rizobios bajo condiciones bacteriológicamente controladas 

Polajnar, M.

Rey Navarro, Luis

Ruiz Argüeso, Tomas-Andres

Sanchez Cañizares, Carmen

Sanchez Jimenez, Paloma

Servicio de Coordinación de Bibliotecas de la Universidad Politécnica de Madrid

II Congreso de Estudiantes Universitarios de Ciencia, Tecnología e Ingeniería Agronómica 
 
 
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CARACTERIZACIÓN SIMBIÓTICA Y FILOGENÉTICA DE RIZOBIOS QUE NODULAN 
LA NUEVA ESPECIE Lupinus mariae-josephi 
 
Sánchez, Paloma; Sánchez Carmen; Polajnar, Mira 
 Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas.Dpto. de Biotecnología. E.T.S.I.Agrónomos. Universidad 
Politécnica de Madrid.  
Correo electrónico: paloma.sanchez.j@gmail.com; mcarmen_s_c@hotmail.com; mira.jagoba@gmail.com 
 
 
RESUMEN  
Una nueva especie de altramuz, Lupinus mariae-josephi, ha sido identificado 
recientemente en Valencia (Pascual, H.). Esta especie, a diferencia de las descritas en la 
Península ibérica y en el viejo mundo, no crece en  suelos ácidos sino en suelos alcalinos 
y con alto contenido en calcio. 
El objetivo general de este proyecto es investigar si existen diferencias fenotípicas y 
genéticas entre los rizobios que nodulan Lupinus mariae-josephi y lupinos de suelos 
ácidos nativos de la Península Ibérica (Lupinus angustifolius, L.luteus y otras cuatro 
especies). 
En este proyecto se han aislado bacterias (rizobios)  de nódulos de L. maria-josephi a 
partir de suelos básicos de Valencia (localidad de LLombai) y se está realizando su 
caracterización a nivel morfológico, nutricional, simbiótico y molecular.  
A nivel molecular se han comparado los genes “housekeeping” 16S rRNA, recA, atpD, 
gln2 y el simbiótico, nodC de diversas cepas que nodulan  L. mariae-josephi y con cepas 
de otras especies de rizobios. 
Por otra parte, también se está evaluando la capacidad de L. mariae-josephi de ser 
nodulada por diferentes rizobios bajo condiciones bacteriológicamente controladas. 
 
Palabras clave: Lupinus, nodulación, rizobios 
 
INTRODUCCIÓN  
El Género Lupinus, de nombre común altramuz, pertenece a la familia de las 
leguminosas; sus semillas, junto con las de la soja son una de las fuentes más ricas en 
proteína vegetal . Es un género de gran interés debido a su capacidad para fijar nitrógeno 
atmosférico, como otras leguminosas, gracias a la simbiosis con bacterias, globalmente 
conocidas como rizobios, mediante la formación de nódulos radiculares en los cuales se 
realiza dicha fijación. Su cultivo se ha realizado desde la antigüedad para la alimentación 
tanto humana como animal y para enterrado en verde con el fin de mejorar la fertilidad de 
los suelos. La mayoría de los lupinos son endémicos de América , pero algunos proceden 
del Viejo Mundo; en la Península Ibérica crecen ocho especies de este género siempre 
en suelos ácidos.  
Una nueva especie de lupino, Lupinus mariae-josephi, ha sido recientemente descubierta 
en una región de Valencia con la especial característica de crecer en suelos alcalinos y 
con  alto contenido en calcio. Las poblaciones de dicha especie se encuentran en peligro 
de extinción por lo que se han definido Microrreservas para su conservación. 
En este proyecto se pretende la caracterización a nivel fisiológico, simbiótico y molecular 
de las cepas de rizobios que nodulan L. mariae-josephi, aisladas a partir de suelos de la 
Región Valenciana mencionada anteriormente mediante el uso de plantas trampa.   
 
MATERIAL Y MÉTODOS  
MATERIAL BIOLÓGICO BACTERIANO: 
Las cepas  utilizadas en este trabajo son las siguientes. 
13 cepas aisladas en nuestro campo: 
• L. mariae-josephi: A2, B1, B1b, B2b, B3, B4, B4a, B4b, C, D2b, D32, H2p, H2. 
37 cepas, varias aisladas de otros lupinos en nuestro campo y otras cedidas por otro 
laboratorio: 
• L.luteus : Islu 8, Islu 15, Islu 23, Islu 78. 
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• L.cosentini : Islu 12, Islu 9. 
• L.hispanicus : Islu 40, Islu 19, Islu 21, Islu39, Islu41. 
• L.angustifolius: Islu101, Islu 22, Islu 28, Islu 38, Islu 90, Islu 98. 
• L.micranthus : Islu 122, Islu 13, Islu14. 
• L.albus : Islu 203, Islu 27. 
• Ornithopus compressus : Islu 16, Islu 33, Islu 127, Islu 154, Islu255, Islu 16/0/3, 
861. 
• Glycine max: Islu SJ92, Islu SJ93, Islu SJ94, Islu SJ98, Islu SJ99.  
• Vigna sp. : 924. 
• Lotus corniculatus: 835, TONO. 
MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO: 
Las cepas de rizobios utilizadas en este estudio se cultivaron a 28ºC en los siguientes 
medios: YMB: extracto de levadura 0,4 g/l, manitol 1g/l, NaCl 0,1 g/l, K2HPO4 0,5 g/l, 
MgSO4 para crecimiento general y conservación de las cepas. ELM: extracto de levadura 
1g/l, manitol 10g/l, NaCl 0,1 g/l, , K2HPO4 0,2 g/l, MgSO4 0,2 g/l, KH2PO4.0,3 g/l, Cl2Ca 
0,05 g/l, Cl3Fe 0,01 g/l.  
EXTRACCIÓN DE ADN TOTAL: 
El ADN total de las diferentes bacterias fue obtenido a partir de 2 ml de cultivo en fase 
exponencial en medio YMB según el método descrito por Corbin et al.(1982) y modificado 
por Leyva et al.(1987). 
AMPLIFICACIÓN DE ADN POR EL MÉTODO DE PCR: 
Las secuencias de los  oligonucleótidos utilizados fueron obtenidos del estudio de varios 
artículos según el gen a amplificar. La técnica de PCR se adaptó para cada gen en 
cuanto a tiempo, temperatura de la fase de anillamiento y concentración de ADN 
empleado. Se han elegido los genes 16S rRNA, recA (recombinasa A), atpD (ATP - asa), 
glnII (Glutamina sintetasa) como  genes de funciones básicas (housekeeping). También 
se ha escogido nodC como gen simbiótico. Una vez obtenidos los productos de 
amplificación de la PCR se purificaron utilizando un Kit comercial “QIAquick PCR 
Purification Kit (250)” y fueron secuenciados por la empresa MACROGEN (Korea). 
ANÁLISIS FILOGENÉTICO: 
Las secuencias obtenidas para cada gen fueron sometidas a un alineamiento previo 
mediante el programa Sequencher con objeto de definir  una región común. Los 
alineamientos de las secuencias fueron obtenidos usando el programa ClustalX  
siguiendo el análisis neighbor-joining de distancias según el número de cambios 
nucleotídicos en las secuencias . Con objeto de elaborar el árbol filogenético más 
probable se realizó un análisis tipo bootstrap. Los árboles filogenéticos obtenidos a partir 
de los alineamientos se visualizaron gracias al programa TreeView. 
CRECIMIENTO DE LAS PLANTAS EN CONDICIONES BATERIOLÓGICAMENTE 
CONTROLADAS: 
En los ensayos realizados para estudiar el comportamiento simbiótico de las cepas 
aisladas de Lupinus mariae-josephi se han utilizado semillas de las siguientes especies: 
L.mariae-josephi, L. luteus, L. cosentini, L. angustifolius, L. albus, L. micranthus, L. 
gredensis, L. hispanicus, Ornithopus compressus, Glycine max., Vigna sp. y Lotus 
corniculatus. De estas semillas, L.mariae-josephi, L. luteus, L. cosentini, L. angustifolius, 
L. micranthus y L. hispanicus fueron escarificadas mecánicamente y esterilizadas 
sumergiéndolas un minuto en alcohol seguido de tres minutos en hipoclorito sódico al 
20% y diez lavados en agua de medio minuto cada lavado. Las demás fueron 
esterilizadas siguiendo el mismo protocolo sin escarificación previa. Las semillas se 
mantuvieron a 28ºC durante varios días para su germinación en agar-agua (1%). Las 
semillas de Ornithopus compressus se mantuvieron a 4ºC (también en agar-agua (1%)) 
durante 48 horas antes de incubarlas a 28ºC para su germinación. Una vez germinadas, 
las semillas se sembraron  en unidades tipo Leonard con vermiculita como soporte inerte. 
Cada unidad se inoculó con 4 ml de cultivo de los correspondientes rizobios en YMB a 
28ºC durante un tiempo determinado dependiente de cada cepa oscilante entre 6 y 10 
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días. Por último, las plantas crecieron en cámara climática provista de iluminación 
(16h/día) y un ciclo de temperatura día/noche de 25ºC / 18ºC entre cuatro y cinco 
semanas. 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Análisis filogenético de las cepas aisladas de la nueva especie L. mariae-josephi : 
• Mediante el análisis de las secuencias del gen 16SrRNA , utilizado 
frecuentemente para clasificar microorganismos, se obtuvieron los siguientes 
resultados: 
Los genes 16SrRNA más parecidos  a los 16SrRNA de los rizobios aislados de L. mariae-
josephi correspondieron a genes de bacterias del género Bradyrhizobium. Dentro del 
genero Bradyrhizobium, la especie más próxima a los aislados de L. mariae-josephi 
correspondió a B.elkani. En una comparación filogenética del gen 16SrRNA con genes de 
bacterias de la familia Rizhobiaceae, se observó que todos los genes de rizobios 
procedentes de L. mariae-josephi se agrupaban separados de los genes de bacterias que 
nodulan otros lupinos de la Península Ibérica. Se observó que en el análisis de este gen, 
las cepas  de rizobis están alejadas de cepas del género Mesorhizobium, Sinorhizobium, 
Azorhizobium y Rhizobium. 
• El análisis del gen nodC, implicado en la nodulación de leguminosas, mostró unas 
relaciones filogenéticas distintas a las encontradas con el gen 16SrRNA. 
En este análisis se observó que : 
Los genes nodC  de las bacterias aisladas de L. mariae-josephi volvieron a agrupar en 
conjunto y separados del grupo de las bacterias aisladas de lupinos de la Península 
Ibérica. 
La proximidad de las cepas de L. mariae-josephi en este caso es mayor con las cepas 
aisladas de lupinos de la península que con las cepas de B.elkani, Mesorhizobium y 
Sinorhizobium. Estas diferencias son debidas a la influencia de la planta (Lupinus) en la 
selección de los genes simbióticos que determinan la nodulación. El gen nodC codifica 
para la quitina sintetasa que fija la longitud de los factores de nodulación. 
 
Figura1. Árbol filogenético 16SrRNA                      Figura2. Árbol filogenético nodC 
 
Caracterización simbiótica de las cepas aisladas de L. mariae-josephi: 
Los ensayos de nodulación cruzada fueron realizados en dos vertientes diferentes : por 
un lado se pretendió estudiar la capacidad simbiótica de las cepas aisladas en L. mariae-
josephi para nodular especies de lupinos de la península y otras leguminosas cercanas; 
por otro lado, se analizó la especificidad simbiótica de L. mariae-josephi para ser 
nodulada por  cepas aisladas de lupinos de suelos ácidos. 
Estos ensayos han revelado que las cepas procedentes de L. mariae-josephi no nodulan 
L. angustifolius, L. luteus, L. micranthus y L. gredensis ni L. hispanicus. No obstante, 
dichas cepas sí nodulan y fijan nitrógeno aunque pobremente con L.cosentini y L.albus; la 
nodulación de L. albus por cepas de L. mariae-josephi no es muy significativa ya que esta 
especie es nodulada por una amplia gama de rizobios. Estas cepas, nodulan pobremente 
a Vigna sp., pero sin fijar nitrógeno. 
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Se observó también que las cepas aisladas de L. angustifolius, L. luteus, L. albus, L. 
cosentini, L. micranthus y Vigna sp. nodulan escasamente a L. mariae-josephi, pero no 
fijan nitrógeno. 
 
CONCLUSIONES 
Las cepas aisladas de la nueva especie L. mariae-josephi, pertenecen al género 
Bradyrhizobium en base al anáilis del gen 16SrRNA. Estos datos preliminares sugieren 
que los los rizobios aislados de L. mariae-josephi están más próximos a B.elkani que a 
los rizobios aislados de lupinus de suelos ácidos nativos de la península.En base al 
análisis de nodC se pudo observar que las cepas procedentes de L. mariae-josephi  se 
asemejan a las cepas procedentes de especies de lupinos de la península que a B.elkani, 
posiblemente por la importancia de la planta hospedadora en la relación de los genes 
simbióticos. 
Se puede concluir de este trabajo que los rizobios que nodulan L. mariae-josephi  en 
suelos alcalinos y calcáreos poseen características simbióticas y genéticas distintas de 
los rizobios de lupinos que crecen en suelos ácidos en la Península Ibérica. Entre estas 
características se han destacado la especificidad tanto en nodulación como en fijación de 
nitrógeno, de L. mariae-josephi con respecto a dichos lupinos con excepción de L. 
cosentini y L.albus. 
Además, la caracterización fisiológica revela un mayor tiempo de generación para las 
cepas nodulantes de L. mariae-josephi que en el resto de las cepas de Bradyrhizobium.  
 
AGRADECIMIENTOS 
Gracias a todo el equipo del laboratorio, Luís, Tomás, Pepe, Belén, Juan, Anabel, Carmen, Victor, Rosabel, 
Javier… por ayudarme siempre que lo necesito cada día, uno tras otro; gracias por vuestra paciencia. 
 
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Caracterización simbiótica y filogenética de rizobios que nodulan la nueva especie Lupinus mariae-josephi

Archivo Digital UPM

http://oa.upm.es/5623/2/INVE_MEM_2009_69155.pdf

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