A new method for constructing linker scanning mutants

A new procedure for the construction of linker scanning mutants is described. A plasmid containing the target DNA is randomly linearized and slightly shortened by a novel combination of established methods. After partial apurination with formic acid a specific nick or small gap is introduced at the apurinic site by exonuclease III, followed by nuclease S1 cleavage of the strand opposite the nick/gap. Synthetic linkers are ligated to the ends and plasmids having the linker inserted in the target DNA are enriched. Putative linker scanning mutants are identified by their topoisomer patterns after relaxation with topoisomerase I. This technique allows the distinction of plasmids differing in length by a single basepair. We have used this rapid and efficient strategy to generate a set of 32 linker scanning mutants covering the chicken lysozyme promoter from –208 to +1

Tissue-specific DNase I-hypersensitive sites in the 5´flanking sequences of the trytophane oxygenase and tyrosine aminotransferase genes

The genes for tryptophan oxygenase (TO) and tyrosine aminotransferase (TAT) are expressed in a tissue- and development-specific manner and are regulated by glucocorticoids (TO and TAT) and glucagon or its intracellular mediator cAMP (TAT) in rat liver. We have analyzed the chromatin structure of these genes in the vicinity of the 5' ends with regard to DNaseI hypersensitivity and have found DNaseI hypersensitive sites upstream of each of the promoters. Mapping of this region reveals three closely spaced cleavage sites near the TO promoter and a doublet of sites near the TAT promoter. In both genes additional cleavage sites are found further upstream. All hypersensitive sites of both genes are absent in kidney nuclei and therefore appear to be specific for the tissue expressing the genes. A correlation of expression and modified chromatin structure was also observed in a hepatoma cell line expressing TAT but not TO: hypersensitive sites are present in TAT but not in TO chromatin. Upon glucocorticoid induction an additional hypersensitive site is detected approximately 2 kb upstream of the TAT promoter in liver and hepatoma cells

Das endogene Retrovirus HTDV/HERV-K: Untersuchungen zur Funktion des akzessorischen Proteins Rec

Retroviren benutzen für die Transkription und Translation ihrer Gene den zellulären Transkriptions– und Translationsapparat. In eukaryotischen Zellen wird die RNA nach der Transkription prozessiert, erst danach verlässt sie den Kern. Die RNA Prozessierung beinhaltet u.a. das vollständige Entfernen von Intronsequenzen (Spleißen). Bei Retroviren erfolgt die Translation bestimmter Proteine (Gag, Pol, Env) von ungespleißten und unvollständig gespleißten Transkripten. Um den nukleären Export dieser Transkripte sicherzustellen, haben Retroviren unterschiedliche Mechanismen entwickelt. Bei dem humanen endogenen Retrovirus HERV K wird der Transport der ungespleißten und unvollständig gespleißten RNA über ein RNA Adaptor Protein reguliert. Solche posttranskriptionellen Regulatorproteine findet man auch bei anderen komplexen Retroviren, wie HIV und HTLV. Die regulatorischen Proteine HIV/Rev und HTLV/Rex sind sehr gut untersucht. Rev und Rex binden über sequenzspezifische Motive an charakteristische Bereiche auf der viralen RNA, die responsiven Elemente. Für die Ausbildung eines funktionalen Exportkomplexes müssen Rev und Rex auf der RNA oligomerisieren. In einem zweiten Schritt bilden Rev und Rex einen Komplex mit dem zellulären Exportrezeptor Crm1, der den Export des RNA/Protein-Komplexes vermittelt. Das HERV K spezifische RNA Adaptor Protein Rec zeigt große Ähnlichkeit zu Rev und Rex. Auch Rec bindet an einen charakteristischen Bereich auf der viralen RNA, das Rec responsive Element (RcRE). In unabhängigen in vivo und in vitro Funktionsanalysen konnte gezeigt werden, dass die Bindung von Rec an das RcRE nicht, wie bei Rev und Rex, über ein sequenzspezifisches Motiv erfolgt. Mehrere „Stem Loop“ Strukturen sind am Aufbau eines funktionalen Exportkomplexes beteiligt. Die Deletion von jeweils einer von vier relevanten „Stem-Loop“ Strukturen führt in vitro nicht zum Verlust der Rec Bindung, in vivo wird aber der Aufbau eines aktiven Exportkomplexes verhindert. Für einen funktionalen Rec/RcRE Komplex sind offensichtlich mehrere Kontaktpunkte wichtig. Rev und Rex binden über eine argininreiche Domäne an ihre responsiven Elemente. Rec besitzt ebenfalls eine argininreiche Domäne, die für die RNA Bindung von Bedeutung ist. Im Rahmen dieser Dissertation konnte mit Hilfe von in vitro RNA Protein Bindungsstudien gezeigt werden, dass neben der argininreichen Domäne noch weitere Aminosäuren im Bereich von zwei leucinreichen Domänen für die RcRE Bindung von Bedeutung sind. Die Mutation des Tryptophan an Position 50 sowie der Leucin Reste an Position 53, 77 oder 78 führte jeweils zum Verlust der RNA Bindung. Aufgrund der physikalischen Eigenschaften dieser Aminosäuren kommt nur das Tryptophan als potentieller Kontaktpunkt zur RNA in Frage. Die übrigen Leucin Reste sind wahrscheinlich für die richtige Faltung des Proteins von Bedeutung. Zusammenfassend haben die Untersuchungen zum RcRE und zur RNA Bindedomäne von Rec ergeben, dass für einen funktionalen Rec/RcRE Komplex sowohl Rec als auch RcRE RNA eine bestimmte Struktur besitzen müssen. Bei Rev und Rex ist Oligomerisierung essentiell für den Aufbau eines funktionalen Exportkomplexes. Die Befunde aus den in vivo Funktionstests und in vitro RNA Protein Bindungsstudien, die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführt wurden, legen nahe, dass Multimerisierung auch bei Rec für die Funktion essentiell ist. Im Unterschied zu Rev und Rex, scheint Rec nur als Dimer oder maximal als Tetramer an das RcRE zu binden und nicht als Oligomer. Der Export der viralen Transkripte erfolgt bei Rev und Rex im Komplex mit Crm1. Im Rahmen dieser Arbeit konnten wir mit Hilfe von Crm1 Kompetitionsexperimenten, die mit „Pendel“ Proteinen, die das NES von Rev und Rex trugen, durchgeführt wurden, indirekt zeigen, dass Crm1 am Rec abhängigen RNA Export beteiligt ist. Über Ko Immunpräzipitation ist es uns gelungen eine direkte Interaktion zwischen Crm1 und Rec nachzuweisen. Crm1 bindet häufig über leucinreiche Exportsignale (NES) an sein Exportcargo. Im Rahmen dieser Arbeit konnten wir erstmals zeigen, dass sich das NES von Rec im Bereich der zweiten leucinreichen Domäne (AS 77-83) befindet und nicht, wie in der Literatur beschrieben, im Bereich der ersten leucinreichen Domäne (AS 50-59) lokalisiert ist. Die Untersuchungen deuten auch darauf hin, dass das NES von Rec nur im Rahmen der nativen Rec Struktur funktional ist. Zusammenfassend haben die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen gezeigt, dass die drei regulatorischen Proteine Rev, Rex und Rex zwar die gleiche Funktion besitzen, dass sich aber die Funktionsweise von Rec deutlich von der von Rev und Rex unterscheidet. Während bei Rev und Rex die Funktion über Sequenzmotive gesteuert wird, spielt bei Rec die Proteinfaltung eine entscheidende Rolle

Phosphorylierung und Gap Junctions - Charakterisierung der Interaktion von Connexin 43 mit der Ubiquitin-Protein-Ligase Nedd4

Das Gap Junction Protein Connexin 43 (Cx43) ist ein integrales Membranprotein mit einer sehr kurzen Halbwertszeit, dessen Abbau am Lysosom sowie am Proteasom erfolgt. Die Funktion von Cx43 wird über posttranslationale Modifikationen wie Ubiquitinierung und Phosphorylierung reguliert. Die Phosphorylierung des Proteins durch verschiedene Kinasen kann sich dabei positiv, aber auch negativ auf die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions auswirken. So ist z. B. die Phosphorylierung von Cx43 an den Serinresten S279 und S282 ausreichend, um eine Zell-Zell-Kommunikation zu inhibieren. Um die Auswirkungen einer S279/S282-Phosphorylierung von Cx43 näher zu untersuchen, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit der polyklonale Antikörper SA226P entwickelt und hergestellt. SA226P ist gegen ein Peptid gerichtet, das die beiden Serinreste S279 und S282 aus dem zytoplasmatischen Carboxy-Terminus (C-Terminus) von Cx43 in phosphorylierter Form enthält. In der indirekten Immunfluoreszenz unbehandelter Zellen wurde mit dem Antikörper SA226P eine schwache Färbung in den Zellkernen detektiert, die auf die Anwesenheit von S279/S282-phosphoryliertem Cx43 hinweist. Dagegen war eine durch den epidermalen Wachstumsfaktor bedingte S279/S282-Phosphorylierung stets an die Lokalisation von Cx43 in den Gap Junction Plaques gekoppelt. In Untersuchungen zu möglichen Bindungspartnern von Cx43 konnte die Ubiquitin-Protein-Ligase „neural precursor cell expressed, developmentally downregulated 4“ (Nedd4) als neuer Interaktionspartner identifiziert werden. Durch Pulldown-Analysen mit Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteinen der drei Protein-Protein-Interaktions-Domänen (WW1, WW2 und WW3) von Nedd4 wurde nachgewiesen, dass WW2 und WW3, nicht aber WW1 an den C-Terminus von Cx43 binden. Dass die WW2-Domäne spezifisch, aber in einer phosphorylierungsunabhängigen Weise an das PY-Motiv von Cx43 bindet, wurde mittels „Surface Plasmon Resonance“-Analysen gezeigt. Die Bindung der WW3-Domäne an andere Motive des C-Terminus von Cx43 scheint dagegen durch den Phosphorylierungsstatus von Cx43 reguliert zu werden. Diese zunächst in vitro gezeigte Interaktion von Cx43 und Nedd4, wurde in vivo in der indirekten Doppelimmunfluoreszenz durch eine Kolokalisation von Cx43 und Nedd4 in den multivesikulären Körpern bestätigt. Anhand der Ergebnisse mit Antikörper SA226P konnte gezeigt werden, dass die S279/S282-Phosphorylierung von Cx43 während der Mitose eine bedeutende Rolle spielt. So konnte eine Kolokalisation speziell von S279/S282-phosphoryliertem Cx43 mit Nedd4 und Ubiquitin in den Centrosomen von mitotischen Zellen nachgewiesen werden. Zudem wurden in mitotischen Zellen die Cx43-Proteine, die sich in Gap Junction Plaques an der Plasmamembran befanden, neben anderen Aminosäureresten in großem Maße an den beiden Serinresten S279 und S282 phosphoryliert. Es ist daher anzunehmen, dass die Phosphorylierung der beiden Serinreste S279 und S282 während der Mitose als eine Art Transportsignal fungiert, das zur gezielten Ubiquitinierung von Cx43 durch Nedd4 in den Centrosomen beiträgt. Experimente mit dem Proteasom-Inhibitor Lactacystin ergaben, dass ausschließlich phosphorylierte, und vor allem S279/S282-phosphorylierte Formen von Cx43, die in Gap Junction Plaques an der Plasmamembran lokalisiert sind, am Proteasom abgebaut werden. Damit weisen auch diese Ergebnisse darauf hin, dass eine bestimmte Hyperphosphorylierung von Cx43, die die beiden Serinreste S279 und S282 einschließt, zu einer Internalisierung der Gap Junction Kanäle führt, um am Proteasom abgebaut zu werden

Transcription factor Sp2: Molecular characterization and generation of Sp2 gene targeted mice

Summary The Sp family of transcription factors is characterised by its DNA-binding domain, an array of three conserved C2H2 zinc fingers. As a consequence of the conserved DNA binding motif, Sp members recognize GC (GGGGCGGGG) and GT (GGTGTGGGG) boxes with similar specificity and affinity. GC and GT boxes are im-portant for the expression of many different ubiquitous as well as tissue-specific cellular and viral genes. To date, nine members of the Sp family (Sp1 - Sp9) have been identified. In addition to their DNA-binding domain, Sp1 - Sp4 also share other structural features like two glutamine-rich transactivation domains and two serine/threonine-rich regions. Molecular and functional properties have been de-scribed for Sp1, Sp3 and Sp4. Mouse deletion mutants, which have been gener-ated for these factors, demonstrate their manifold function and essential impor-tance for mammalian development. Since the cloning of Sp2, which is the less conserved factor among Sp1 - Sp4, no reports about its function, neither in vitro nor in vivo have been published. Therefore, the aim of this thesis work was to unravel Sp2 function by two parallel approaches: a functional molecular characterization (including expression, transactivation and DNA binding studies) and the generation of Sp2 gene targeted mice. To study the Sp2 protein at the molecular level, Sp2-specific rabbit polyclonal anti-bodies were generated. Sp2 protein, which is exclusively localized to the nucleus, was detected in all analyzed cell lines and adult mouse tissues, although in differ-ent amounts. This favours at least a widely expression of the transcription factor Sp2. To explore Sp2 transactivation properties, reporter assays were performed with full-length Sp2 protein as well as various Sp2 deletion mutants using different GC- and GT-box-containing promoters. Unlike transcription factor Sp1, which is a strong activator, Sp2 proteins did not activate reporter gene expression. Also, when fusing Sp2 deletions to a heterologous Gal4 DNA binding domain, no activation was detectable. In addition, the DNA binding capacity and specificity of full-length Sp2 protein and a series of Sp2 deletion mutants were investigated by Electropho-retic Mobility Shift Assays. Full-length Sp2 protein was not able to bind to DNA, nei-ther to GC boxes (the “classical” Sp1 binding site) and GC box variants, nor to other DNA binding sequences like GT and CT boxes. However, when deleting the N-terminal amino acids 1-179, GC box binding was possible. These results suggest that the DNA binding activity is regulated in vivo. To unravel the physiological func-tion of transcription factor Sp2, targeted mice were generated. These mice are not viable; they die shortly before or after birth. Whereas Sp2-targeted embryos develop normal until day E12.5, day E18.5 embryos are characterized by a strongly reduced body size and weight, however with strong variations. These results demonstrate a fundamental role of the transcription factor Sp2 for normal mouse development

A thyroid hormone receptor-dependent glucocorticoid induction.

Glucocorticoid and thyroid hormones exert their effects in many body tissues by binding to their respective receptors. The search for possible cross-talking mechanisms in overlapping target cells led to the discovery of synergism between a thyroid hormone receptor-binding site and a cryptic glucocorticoid-responsive element. Glucocorticoid responsiveness could only be detected in the presence of thyroid hormone and its receptor. This synergism requires the glucocorticoid receptor (GR) DNA-binding domain and is mediated by the transactivation domains. We found that synergism also occurs when the thyroid hormone receptor is replaced by the retinoic acid receptor or the GR is replaced by the progesterone receptor. Synergism is qualitatively independent of the type of thyroid hormone receptor-binding site and promoter. In several combinations of promoter and response elements, including a retinoic acid response element, T3 induction was only seen in the presence of the cryptic glucocorticoid-responsive element, GR, and glucocorticoids

Chromatin condensation during Drosophila spermiogenesis and decondensation after fertilization.

Eine typische Eigenschaft der männlichen Keimzellen ist die Kondensation des Chromatins. Während in Säugern bekannt ist, dass in der Spermiogenese die Histone zuerst durch Transitionsproteine und dann durch Protamine ersetzt werden, ist in Drosophila wenig darüber bekannt. Im Folgenden charakterisiere ich die drei testisspezifisch exprimierten Drosophila Gene Mst35Ba, Mst35Bb und Mst77F. Mit eGFP Fusionsproteinen zeige ich, dass Mst35Ba und Mst35Bb tatsächlich für dProtA (Drosophila ProtaminA) beziehungsweise dProtB (Drosophila ProtaminB) kodieren und eine Identität von 94% zueinander zeigen. Die Protamine von Drosophila sind beträchtlich größer als die der Säuger, enthalten aber ebenfalls beide typische Cystein/Arginin Blöcke. Die ektopische Expression von dProtA und dProtB in den Speicheldrüsen führt zur ausschließlichen Lokalisation dieser Proteine im Kern. Beide Protamine binden an die Polytänchromosomen ohne irgendeine Präferenz für das Eu- oder Heterochromatin, was das Bindeverhalten der Protamine in den Kernen der Spermien widerspiegelt. Anders als in Säugern sind die Protamingene von Drosophila nicht haploinsufficient. Bei der Durchmusterung der Mutantenkollektion aus dem Zuker-Labor konnte keine Mutation in einem der beiden Protamingene gefunden werden, was für eine funktionelle Redundanz spricht. Mst77F kodiert für ein spermatidenspezifisches Linker-Histon-ähnliches Protein. Das Expressionsmuster von Mst77F deckt sich mit dem der Protamine. Mst77F zeigt große Ähnlichkeit zum Säugerprotein HILS1. ProtaminA-eGFP, ProtaminB-eGFP und Mst77F-eGFP tragende transgene Drosophila-Linien zeigen, dass diese Proteine zu wichtigen chromosomalen Proteinbestandteilen ab dem Kanustadium elongierender Spermatiden und in den Kernen reifer Spermien werden, während His2AvDGFP im Kanustadium abgebaut wird. Der Übergang von der nukleosomalen zu der auf Protaminen basierenden Chromatinkonfiguration findet also im Kanustadium der Spermatidenentwicklung statt. Mst77F Mutanten (ms(3)nc3) zeichnen sich durch kleine runde Kerne aus und sind männlich steril. Diese Daten lassen vermuten, dass der generelle Mechanismus der Chromatinkondensierung in Drosophila mit dem in Säugern vergleichbar ist. Während des Kanustadiums der Spermatidenentwicklung wird Histon H2AvD abgebaut. Im Folgenden zeige ich eine neue Funktion von UbcD1, einem E2-Ubiquitin konjugierenden Enzym, das für den Abbau von H2AvD nötig ist. Auch die E3 Ligasen Cullin-1 und Cullin-3 werden beide während der Drosophila Spermatogenese exprimiert. Cullin-1 wird in allen frühen Keimzellen in den Fusomen exprimiert und während der Meiose abgebaut. In späteren Stadien wird Cullin-1 erneut exprimiert und ist während des Kanustadiums der Spermatidendifferenzierung im perinuklearen Bereich lokalisiert. Cullin-3 wird in den elongierten Spermatiden exprimiert. Während der frühen Befruchtungsstadien enthält der väterliche Pronukleus noch Protamine und Mst77F, gewinnt aber vor der Zygotenbildung eine nukleosomale Konfiguration. In den von Sesame-mutanten Weibchen gelegten Eiern behält der väterliche Pronukleus die auf Protaminen basierende Chromatinkonfiguration bei, während Mst77F-eGFP entfernt wird. Dies deutet darauf hin, dass das sesame Genprodukt (HIRA) für den Abbau der Protamine essentiell ist, während der Abbau von Mst77F unabhängig von Sesame erfolgt

In der Myogenese von Drosophila melanogaster interagiert Rolling pebbles 7 in den Z-Scheiben der Sarkomere mit α-Aktinin und D-Titin/Kettin/Zormin, in der terminalen Z-Scheibe kolokalisiert es zudem mit Dumbfounded/Kirre

Das Rols7-Protein hat eine essentielle Funktion bei der Myoblastenfusion in der Embryonalentwicklung von Drosophila melanogaster. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Relevanz der Protein-Protein- Interaktionsdomänen RING-Finger und Ankyrin-Repeats für die subzelluläre Lokalisation von Rols7, die während der Myoblastenfusion an der Zellmembran nachgewiesen werden kann. Dazu wurden die RING-Finger-Domäne und drei der neun Ankyrin-Repeats zusammen mit den ersten 20 bzw. den ersten 309 Aminosäuren des Rols7-spezifischen Teils und einem bzw. sechs Myc-tags als Fusionsprotein mit Hilfe des UAS-GAL4-Systems im Mesoderm von Drosophila exprimiert. Die Fusionsproteine konnten allerdings nur fehlerhaft lokalisiert am bzw. um den Zellkern nachgewiesen werden. Eine Abhängigkeit der Fehllokalisation von einem Kernlokalisationssignal, das im Bereich der 309 Rols7-spezifischen Aminosäuren vorausgesagt wird, konnte nicht nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Expression der Fusionsproteine im Mesoderm keinen dominant-negativen Effekt hervorruft, während eine Expression in der Augen-Imaginalscheibe zu einer verringerten Anzahl an Ommatidien führt. Ein weiteres Ziel war zu klären, ob für Rols7 eine weitere Funktion während der späten Stadien der Myogenese nachgewiesen werden kann. Rols7 wird erneut ab Stadium 16/17 exprimiert und ist im Embryo zunächst an den Muskelanheftungsstellen lokalisiert, an denen außerdem eine transiente Expression von Dumbfounded/Kin of irregular chiasm-C (Duf/Kirre), mit dessen intrazellulärer Domäne Rols7 interagiert, detektiert werden konnte. Für Duf/Kirre wird daher postuliert, dass es über eine Interaktion mit Roughest/Irregular-chiasm-C in der Tendonzelle den ersten Kontakt der auswachsenden Myotube zur Epidermis vermittelt. Während dieses Prozesses interagiert Rols7 mit Duf/Kirre auf der Seite der Muskeln und baut mit D-Titin/Kettin und α-Aktinin die terminale Z-Scheibe des Muskels auf. Diese drei Proteine sind ebenfalls am Aufbau der Sarkomere beteiligt, die sich kurz nach den terminalen Z-Scheiben bilden. In der larvalen Muskulatur konnte Rols7 somit, abgesehen von den terminalen Z-Scheiben, auch in den Z-Scheiben der Sarkomere in Kolokalisation mit D-Titin/ Kettin und α-Aktinin nachgewiesen werden. Interaktionstests im Hefesystem zeigten, dass das R1-Fragment von Rols7, welches den RING-Finger enthält, mit dem N-Terminus von Zormin, einer Isoform, die sich vom sls-Gen abgeleitet, und mit α-Aktinin interagiert. In Kombination mit Ergebnissen aus Menon et al., 2005, konnte dem R1-Fragment von Rols7 eine Funktion beim Aufbau der terminalen Z-Scheibe und der Z-Scheiben der Sarkomere zugeordnet werden, während die Ankyrin-Repeats und die TPR-Repeats eine Rolle in der Myoblastenfusion zu spielen scheinen

Die UVB-abhängige Induktion des Vaskulären Endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) wird in epidermalen Zellen autokrin durch den Transformierenden Wachstumsfaktor alpha (TGF@) reguliert: Bedeutung für die UVB-induzierte

Ein Zusammenhang zwischen chronischer Sonnenexposition der Haut und vermehrter Bildung von Gefäßen bei der Photoalterung und Photokarzinogenese der Haut mit vorzeitiger Alterung und Ausbildung nicht-melanozytärer und melanozytärer Tumoren der Haut kann als wissenschaftlich gesichert angesehen werden. Teleangiektasien, die durch eine Zunahme und Vergrößerung kutaner Blutgefäße gekennzeichnet sind, und die Entwicklung stark vaskularisierter Hauttumoren sind charakteristische Endpunkte einer chronisch sonnenexponierten und sonnengeschädigten Haut. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen der UV-induzierten pathophysiologischen Angiogenese sind weitgehend unbekannt. In der Tumorprogression sind Angiogenesefaktoren wie der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor VEGF, ein multifunktionales Zytokin mit mitogener Aktivität für Endothelzellen, von zentraler Bedeutung, da Tumorwachstum und -metastasierung von der Ausbildung eines tumorversorgenden Blutgefäßsystems abhängig sind. In der vorliegenden Arbeit sollte mit molekularbiologischen und zellbiologischen Methoden untersucht werden, ob und in welcher Form solare UVB-Strahlung als schädigende Komponente des Sonnenlichts auf der Erdoberfläche die Regulation von VEGF beeinflußt. Es konnte gezeigt werden, daß UVB-Bestrahlung den Angiogenesefaktor VEGF in epidermalen Zellen auf Proteinebene mit biphasischer Expression nach 4 bzw. 24 h maximal induziert. In Untersuchungen der UVB-induzierten VEGF-Promotoraktivität wurde durch transiente Transfektionen von HaCaT-Zellen mit Deletionskonstrukten des humanen VEGF-Promotors und in Experimenten unter Verwendung neutralisierender Antikörper der transformierende Wachstumsfaktor alpha (TGF) als Mediator der sekundären VEGF-Expression nach UVBBestrahlung identifiziert. Die primäre Induktion von VEGF und die Synthese von TGF sind abhängig von der UVB-Aktivierung des EGF-Rezeptors (EGF-R) und konnten durch den EGF-R-spezifischen Tyrosinkinase-Inhibitor PD 153035 signifikant inhibiert werden. Die UVB-abhängige VEGF-Expression wurde in vivo in menschlicher Haut immunohistologisch bestätigt. Durch die signifikante Verminderung der UVB-abhängig gesteigerten Angiogenese in der Epidermis repetitiv bestrahlter haarloser Mäuse konnte nach intraperitonealer Injektion neutralisierender Antikörper gegen VEGF die kausale Bedeutung von VEGF in vivo im Mausmodell belegt werden. Zusammengefaßt konnten in dieser Arbeit in vitro und in vivo die Bedeutung von VEGF für angiogenetische Prozesse nach UVB-Exposition herausgearbeitet und wesentliche Wege seiner Signaltransduktion identifiziert werden

CIS-acting elements controlling the expression of the human GLI3 gene

Die Entwicklung der Gliedmaßen ist ein komplexer Vorgang, der zahlreiche molekulare Faktoren und Signalwege involviert. Diese dirigieren während der Embryogenese die Umwandlung der Gliedmaßenknospe zu den fertigen Extremitäten. Die antero-posteriore Musterbildung wird vom Signalmolekül „sonic hedgehog“ gesteuert, das über die GLI-Transkriptionsfaktoren die Transkriptionsaktivität von Zielgenen reguliert. Zeit, Lokalisierung und Menge der GLI-Transkription sind von kritischer Bedeutung. Mutationen, die das Vorhandensein der notwendigen Menge dieser Faktoren in den Zellen beeinflussen oder ihre Funktion stören, können in den Gliedmaßenknospen zu Wachstumsdefekten und andernorts zur Krebsentstehung führen. Um einen Beitrag zum Nachweis und zur funktionellen Charakterisierung von cis-regulatorischen Elementen von GLI3 und deren potentieller Bedeutung für die Pathogenität zu liefern, wurden in dieser Dissertation drei Fragen bearbeitet: · Wie wird die Expression von humanem GLI3 reguliert? · Besitzen GLI2 und GLI3 ähnliche regulatorische Elemente? · Sind Mutationen in regulatorischen Elementen von GLI3 an der Pathogenität involviert? Um letzteres vorzubereiten wurden 24 Patienten mit Gliedmaßendefekten, die als potentielle GLI3-Morphopathien klassifiziert waren, auf Punktmutationen hin untersucht. 20 Fälle, bei denen keine Mutation in der kodierenden Sequenz gefunden werden konnte, sind Kandidaten für eine Mutationssuche in cis-regulatorischen Elementen. An der Kontrolle der Transkription des GLI3-Gens sind die Promoterregion und andere cis-aktive Sequenzen, wie Enhancer, beteiligt. Ein minimaler Promotor wurde definiert und funktionell getestet. Zwei Initiationsstellen der Transkription wurden mit cDNA aus Plazenta und Skelettmuskeln identifiziert. Durch Mutagenese wurden Sequenzelemente, die an der Kontrolle der GLI3-Expression beteiligt sind, eingegrenzt. Funktionelle Studien an transgenen Mäusen hatten gezeigt, dass die Expressionsdomänen von GLI2 und GLI3 in großen Bereichen überlappen. Die transkribierte Region von GLI2 wurde im 5’-Bereich gegenüber der bekannten cDNA um 1 kb nicht kodierender DNA ausgedehnt. Trotzdem konnten Sequenzvergleiche zwischen Mensch und Maus keine Homologie zwischen regulatorischen Elementen von GLI2 oder GLI3 entdecken. Die genomische Sequenz von GLI3 wurde für evolutionäre Vergleiche benutzt, um nach hochkonservierten, nicht-kodierenden Elementen zu suchen, die eventuell cis-regulatorische Elemente repräsentieren. Drei so entdeckte potentielle Enhancerelemente wurden in transient transfizierten Zellen daraufhin untersucht, ob sie die Transkription eines Reportergens unter der Kontrolle des minimalen GLI3-Promoters steuern konnten. Durch Mutagenese vorhergesagter Bindungssequenzen für Transkriptionsfaktoren und nachfolgende Analyse der regulatorischen Kapazität der Elemente in zellulären Reportergentests wurden funktionell besonders bedeutsame Stellen definiert. An diese Bereiche bindende Transkriptionsfaktoren, die in die Regulation von GLI3 involviert sein könnten, wie NFATp, müssen noch bestätigt werden. Die drei Elemente wurden ebenfalls auf ihre Fähigkeit hin untersucht, in transgenen Mäusen ein Reportergen zu aktivieren. In transgenen Mausembryonen konnte beobachtet werden, dass eines der potentiellen Enhancerelemente ein Expressionsmuster steuerte, das zeitlich und räumlich einem Teil des endogenen Maus-GLI3-Musters entsprach, vor allem im Gehirn, den Mandibeln, im Nasenbereich und im Herzen. Die erzielten Ergebnisse tragen zum Verständnis der räumlichen und zeitlichen Expressionskontrolle von GLI3 bei, dem Schlüsselfaktor der „sonic hedgehog“- Signalkaskade, und verschaffen einen Einblick in die potentielle Rolle hochkonservierter, nicht-kodierender Sequenzelemente im menschlichen Genom