Zyklisierte zellpenetrierende Peptide für den Wirkstofftransport: Auswirkung auf Stabilität und Internalisierungsmechanismus

Zellpenetrierende Peptide (CPP) werden in den letzten Jahren zunehmend als ein vielversprechender Ansatz für den erfolgreichen Transport bioaktiver Moleküle für therapeutische oder diagnostische Zwecke in die Zelle diskutiert. Gegenüber anderen molekularen Transportern weisen sie eine geringe Toxizität und Immunogenizität auf. Nachteilig sind allerdings die oftmals geringe proteolytische Stabilität und Bioverfügbarkeit. Zur Überwindung dieser Limitierungen und zur Aufklärung des Internalisierungsmechanismus‘ wurden im Zuge dieser Arbeit basierend auf bekannten linearen CPP mittels Festphasensynthese und anschließender kupferkatalysierter Huisgen-1,3-dipolarer Zykloaddition (Klick-Reaktion) in Lösung mit 15-30% Ausbeute zyklische Varianten mit unterschiedlicher Ringgröße hergestellt. Die Charakterisierung der über die Seitenketten funktioneller Aminosäuren zyklisierten CPP erfolgte mit Hilfe unterschiedlicher chromatographischer, spektroskopischer und spektrometrischer Verfahren. Drei auf einem Fragment des amphipathischen, kationischen antimikrobiellen Peptids – sC18 – basierende zyklische CPP mit 4/8/12 Aminosäuren innerhalb des Zyklus‘ besaßen eine 15- fach/21-fach/keine erhöhte Stabilität gegenüber Trypsin und eine um das 4,5-fache/3- fache/4,5-fache gesteigerte Stabilität in humanem Blutplasma. Die zelluläre Aufnahme erhöhte sich mit der Anzahl der im Zyklus inkorporierten Argininreste und erreichte im Falle des großen Zyklus‘ den Wert des linearen Vergleichspeptids. Die beiden letzteren Peptide scheinen dabei eine gewisse Krebszellselektivität zu besitzen, da sie eine zytoplasmatische und nukleare Akkumulation zeigten. In der Nichtkrebszelllinie zeigte sich lediglich eine endosomale Verteilung der Peptide innerhalb der Zellen. Eine Transfektion von MCF-7-Zellen konnte mit allen zyklischen Varianten, insbesondere des großen Zyklus‘, durch nicht-kovalente Komplexierung mit Plasmid-DNS durchgeführt werden. Unter Verwendung artifizieller Liposomen unterschiedlicher Größe und Lipidzusammensetzung konnte eine selektive Anreicherung aller CPP an negativ geladene Liposomen beobachtet werden. Des Weiteren zeigten der kleine und große Zyklus gegenüber dem linearen Peptid eine verstärkte Membranaktivität und Porenbildung. Die Ausbildung einer α-helikalen Sekundärstruktur erfolgte zusammen mit negativ geladenen Liposomen am ausgeprägtesten im Falle des kleinen Zyklus‘ sowie des linearen Peptids. Ein weiteres, vom humanen Calcitonin abgeleitetes zyklische Derivat besteht N-terminal aus einem 11 Aminosäuren umfassenden Ring mit einem sich anschließenden linearen Teil aus 14 Aminosäureresten. Gegenüber Pepsin bzw. in humanem Blutplasma wies es eine 5-fache bzw. um 100% erhöhte Stabilität im Vergleich zum linearen Ursprungspeptid auf. Das Ausmaß an endozytotischer Aufnahme gegenüber direkter Penetration war für beide Peptide in etwa gleichermaßen konzentrations- und zelltypabhängig. Für das zyklische Peptid konnte ein nichtkovalenter Transport eines Zytostatikums gezeigt werden

The AutoAnnotator - Standardized annotation of protein-encoding BioBricks

For protein-encoding BioBricks a large number of useful parameters, such as the amino acid sequence or the molecular weight, can easily be computed. Furthermore alignments against databases and predictions of various features, for instance transmembrane regions, are very interesting and informative when viewing a part. However, this information is not presented or very hard to find in most part descriptions and requires the user to use external websites to obtain it. To resolve this issue we propose a standardized table containing this information. For this purpose we developed a web tool, called the AutoAnnotator, in JavaScript gathering this information and providing the standardized table for the user to copy

Bioconjugation of supramolecular metallacages to integrin ligands for targeted delivery of cisplatin

Cisplatin occupies a crucial role in the treatment of various malignant tumours. However, its efficacy and applicability are heavily restricted by severe systemic toxicities and drug resistance. Our study exploits the active targeting of supramolecular metallacages to enhance the activity of cisplatin in cancer cells while reducing its toxicity. Thus, Pd2L4 cages (L = ligand) have been conjugated to four integrin ligands with different binding affinity and selectivity. Cage formation and encapsulation of cisplatin was proven by NMR spectroscopy. Upon encapsulation, cisplatin showed increased cytotoxicity in vitro, in melanoma A375 cells overexpressing αvβ3 integrins. Moreover, ex vivo studies in tissue slices indicated reduced toxicity towards healthy liver and kidney tissues for cage-encapsulated cisplatin. Analysis of metal content by ICP-MS demonstrated that encapsulated drug is less accumulated in these organs compared to the ‘free’ one

Cyclization of a cell-penetrating peptide via click-chemistry increases proteolytic resistance and improves drug delivery

In this work we report synthesis and biological evaluation of a cell-penetrating peptide (CPP), that is partly cyclized via a triazole bridge. Recently, beneficious properties have been reported for cyclized peptides concerning their metabolic stability and intracellular uptake. A CPP based on human calcitonin was used in this study, and side chain cyclization was achieved via copper catalyzed alkyne-azide click reaction. Cell viability studies in several cell-lines revealed no cytotoxic effects. Furthermore, efficient uptake in breast cancer MCF-7 cells could be determined. Moreover, preliminary studies using this novel peptide as drug transporter for daunorubicin were performed. Copyright (c) 2016 European Peptide Society and John Wiley & Sons, Ltd

Exploring the Role of RGD-Recognizing Integrins in Cancer

Integrins are key regulators of communication between cells and with their microenvironment. Eight members of the integrin superfamily recognize the tripeptide motif Arg-Gly-Asp (RGD) within extracelluar matrix (ECM) proteins. These integrins constitute an important subfamily and play a major role in cancer progression and metastasis via their tumor biological functions. Such transmembrane adhesion and signaling receptors are thus recognized as promising and well accessible targets for novel diagnostic and therapeutic applications for directly attacking cancer cells and their fatal microenvironment. Recently, specific small peptidic and peptidomimetic ligands as well as antibodies binding to distinct integrin subtypes have been developed and synthesized as new drug candidates for cancer treatment. Understanding the distinct functions and interplay of integrin subtypes is a prerequisite for selective intervention in integrin-mediated diseases. Integrin subtype-specific ligands labelled with radioisotopes or fluorescent molecules allows the characterization of the integrin patterns in vivo and later the medical intervention via subtype specific drugs. The coating of nanoparticles, larger proteins, or encapsulating agents by integrin ligands are being explored to guide cytotoxic reagents directly to the cancer cell surface. These ligands are currently under investigation in clinical studies for their efficacy in interference with tumor cell adhesion, migration/invasion, proliferation, signaling, and survival, opening new treatment approaches in personalized medicine

Therapeutic Radiopharmaceuticals Targeting Integrin αvβ6

The epithelial integrin αvβ6 is expressed by many malignant carcinoma cell types, including pancreatic cancer, and thus represents a promising target for radionuclide therapy. The peptide cyclo­(FRGDLAFp­(<i>N</i>Me)­K) was decorated with different chelators (DOTPI, DOTAGA, and DOTA). The Lu­(III) complexes of these conjugates exhibited comparable αvβ6 integrin affinities (IC₅₀ ranging from 0.3 to 0.8 nM) and good selectivities against other integrins (IC₅₀ for αvβ8 >43 nM; for α5β1 >238 nM; and for αvβ3, αvβ5, and αIIbβ3 >1000 nM). Although different formal charges of the Lu­(III) chelates (ranging from 0 to 4) resulted in strongly varying degrees of hydrophilicity (log <i>D</i> ranging from −3.0 to −4.1), biodistributions in murine H2009 xenografts of the Lu-177-labeled compounds (except the DOTPI derivative) were quite similar and comparable to our previously reported αvβ6 integrin positron emission tomography tracer Ga-68-avebehexin. Hence, combinations of existing Ga-68- and Lu-177-labeled c­(FRGDLAFp­(<i>N</i>Me)­K) derivatives could be utilized for αvβ6 integrin-targeted theranostics, whereas our data nonetheless suggest that further improvement of pharmacokinetics might be necessary to ensure clinical success