Distinct p21 requirements for regulating normal and self-reactive T cells through IFN-γ production.

Self/non-self discrimination characterizes immunity and allows responses against pathogens but not self-antigens. Understanding the principles that govern this process is essential for designing autoimmunity treatments. p21 is thought to attenuate autoreactivity by limiting T cell expansion. Here, we provide direct evidence for a p21 role in controlling autoimmune T cell autoreactivity without affecting normal T cellresponses. We studied C57BL/6, C57BL/6/lpr and MRL/lpr mice overexpressing p21 in T cells, and showed reduced autoreactivity and lymphadenopathy in C57BL/6/lpr, and reduced mortality in MRL/lpr mice. p21 inhibited effector/memory CD4(+) CD8(+) and CD4(-)CD8(-) lpr T cell accumulation without altering defective lpr apoptosis. This was mediated by a previously non-described p21 function in limiting T cell overactivation and overproduction of IFN-γ, a key lupus cytokine. p21 did not affect normal T cell responses, revealing differential p21 requirements for autoreactive and normal T cell activity regulation. The underlying concept of these findings suggests potential treatments for lupus and autoimmune lymphoproliferative syndrome, without compromising normal immunity.This work was supported by grants from the Ministry of Economy and Competitivity (MINECO)/Instituto Carlos III (PI081835 PI11/00950) and the CAM (MITIC S2011/ BMD2502) to DB, and from the MINECO (SAF2010-21205 and PIB2010BZ-00564) and the CAM (MITIC S2011/BMD2502) to CMA.Peer reviewe

Le rôle du APC (Anaphase-Promoting Complex) au cours de la phase G2/M après dommage de l ADN

Les agents permettant de créer des dommages sur l ADN sont principalement utilisés dans les traitements contre le cancer. L activation de points de contrôle du cycle cellulaire après lésion de l ADN entraîne un arrêt du cycle des cellules. De la connaissance des mécanismes moléculaires de l arrêt du cycle cellulaire par ces points de contrôle dépend l efficacité du traitement. Dans les cellules humaines, ces points de contrôle sont primordiaux puisque leur inactivation entraîne la carcinogenèse (génération de cancers). Après traitement par des agents chimiothérapiques et des rayons X, les cellules s arrêtent en phase G-1 et G-2/Mitose (M) du cycle cellulaire. Si de nombreuses études ont permis de clarifier les mécanismes de l arrêt en phase G-1 pour des cellules dont l ADN est endommagé, peu de données sont disponibles concernant l arrêt en phase G-2/M. Parmi ces points de contrôle, le point de contrôle G-2/M est particulièrement important car il prévient l entrée en mitose (phase M) des cellules dont l ADN est endommagé. Nous avons analysé le rôle du complex appelé APC (Anaphase-Promoting Complex) dans les points de contrôle G-2/M après lésion de l ADN. Les lésions de l ADN sont induites dans les cellules synchronisées en phase S. Suite à ces dommages, les cellules montrent un retard et s arrêtent en phase G-2 avec 4N chromosomes. Afin d identifier les bases biochimiques de l arrêt en G-2/M après traitement avec des agents endommageant l ADN, nous allons concentrer notre recherche sur un complexe composé de multiples protéines possédant une activité de ligation de l ubiquitine de type E3 (ubiquitin-ligase E3). Ce complexe APC est necessaire pour la dégradation des inhibiteurs d entrée en anaphase, cyclins mitotiques, et plusieurs kinases mitotiques pour la complétion de la sortie de la mitose. Nous avons analysé et déterminé que l absence d activité du complexe APC inhibe l activation du point de contrôle G-2/M lors de dommages de l ADN.DNA damaging agents are the most widely used treatment in fight against cancer. The effective use of DNA damaging agents for killing tumors depends on understanding the mechanism of DNA damage checkpoint arrest at the molecular level. DNA damage checkpoints impose delays in cell cycle in response to DNA damage. Cells arrest in G2/M after treatment with DNA-damaging agents, such as chemotherapeutic agents and x-rays. In human cells DNA damage checkpoints are of critical importance in carcinogenesis since inactivation of the checkpoint leads to increased rates of mutation, chromosomal loss or aneuploidy. While G-1 arrest after DNA damage has been extensively studied, the mechanism of G2 arrest is less clear. Among the cell cycle checkpoints, G2 is most crucial for preventing entry into mitosis with damaged DNA. We have found a previously unrecognized link between anaphase promoting complex (APC) and G2 checkpoint control after DNA damage. The APC is a large multi-protein complex with E3-ubiquitin ligase activity. APC is best known for regulating progression through mitosis and mitotic exit activity by degradation of various mitotic substrates. APC activity is high from late mitosis until late G-1 phase of the cell cycle. We surprisingly find that APC is activated following DNA damage in cells arrested in G2. DNA damage was induced in synchronized cells in late S phase. Following DNA damage, cells show G2 delay and remain arrested in with a DNA content of 4N. Importantly, we show that down-regulation of APC activity by siRNA technique abolishes G2 checkpoint control after DNA damage. We ve analyzed how DNA damage that leads to APC activation. The specific destruction of a regulator by APC may govern cell cycle arrest after DNA damage.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

ETUDE DU FACTEUR DE REPLICATION C (CARACTERISATION DE NOUVELLES FONCTIONS DE LA LARGE SOUS-UNITE RF-CP145)

LE FACTEUR DE REPLICATION C (RF-C), UN COMPLEXE DE CINQ POLYPEPTIDES SE LIE AUX AMORCES D'ARN ET FIXE LE PCNA SUR L'ADN, ACTIVANT AINSI L'ACTIVITE PROCESSIVE DES ADN POLYMERASES. NOUS AVONS MIS A JOUR, DANS DES CELLULES DE MAMMIFERES, UNE NOUVELLE FONCTION DE RF-C INFLUENCANT LA SURVIE CELLULAIRE APRES L'ENDOMMAGEMENT DE L'ADN. NOUS AVONS DETERMINE QUE LA LARGE SOUS-UNITE DE RF-C, RF-CP145, FAVORISE LA SURVIE CELLULAIRE APRES ENDOMMAGEMENT DE L'ADN PAR RADIATION UV PAR UNE VOIE DE SIGNALISATION DEPENDANTE DE LA PROTEINE DU RETINOBLASTOME (RB). LA COOPERATION ENTRE RF-CP145 ET RB FAVORISANT LA SURVIE CELLULAIRE EST ABROGEE PAR LA MUTATION DU MOTIF LXCXE DE RF-CP145 OU MUTATION DANS RB DU SITE D'INTERACTION AVEC LE MOTIF LXCXE. NOUS SUGGERONS QUE CETTE NOUVELLE FONCTION DE RF-CP145 REQUIERT LA LIAISON AVEC RB VIA LE MOTIF LXCXE. NOUS AVONS PU EGALEMENT ETABLIR QUE LE DOMAINE B DE RF-CP145 PEUT PROMOUVOIR LA SURVIE CELLULAIRE APRES INDUCTION DE L'APOPTOSE PAR TNF- (TUMOR NECROSIS FACTOR-ALPHA) ET BAX. RF-CP145 INHIBE LA CONDENSATION DE LA CHROMATINE, LA FRAGMENTATION DE L'ADN ET L'ACTIVATION DE LA CASPASE-3 INDUITE PAR BAX. NOUS AVONS EGALEMENT MONTRE QUE IN VITRO, RF-CP145 DOMAINE B INHIBE L'ACTIVATION PAR PROTEOLYSE DE LA PRO-CASPASE-3. NOS RESULTATS SUGGERENT QUE L'ACTIVITE ANTI-APOPTOTIQUE DU DOMAINE B EST DIRIGE VERS LA REGULATION DE LA PHASE EXECUTRICE DE LA MORT CELLULAIRE. D'AUTRE PART, NOUS AVONS MONTRE QUE LE DOMAINE DE LIAISON A L'ADN DE RF-C, DOMAINE A, A LA PROPRIETE D'INTERAGIR AVEC DES PROTEINES. L'UNE DES PROTEINES INTERAGISSANT AVEC LE DOMAINE A A ETE CARACTERISE COMME ETANT PARP (POLY(ADP-RIBOSE) POLYMERASE). NOUS AVONS DETERMINE QUE DIFFERENTS ACIDES AMINES DU DOMAINE A SONT IMPLIQUES DANS LA LIAISON AVEC L'ADN ET AVEC PARP. DE PLUS LES DOMAINES BRCT DE XRCC1 ET DE L'ADN LIGASE III INTERAGISSENT AVEC LE DOMAINE A IN VITRO. NOS RESULTATS SUGGERENT QUE NON SEULEMENT RF-CP145 JOUE UN ROLE CENTRAL LORS DE LA REPLICATION DE L'ADN, MAIS POURRAIT EGALEMENT INTERVENIR DANS LA REGULATION DES VOIES DE SIGNALISATION ACTIVEES LORS DE STRESS GENOTOXIQUES. L'ETUDE DE LA REGULATION DE CES VOIES DE SIGNALISATION PAR RF-C EST D'UNE GRANDE IMPORTANCE POUR LA COMPREHENSION DES MECANISMES CONTROLANT LE DEVENIR CELLULAIRE PAR LES ACTEURS DE LA PROGRESSION NORMALE DU CYCLE CELLULAIRE.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

CARACTERISATION DE PROTEINES IDENTIFIEES COMME INTERAGISSANT AVEC L'INHIBITEUR DU CYCLE CELLULAIRE P21 W A F 1 / C I P 1

GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Phosphorylation of the PCNA binding domain of the large subunit of replication factor C on Thr(506) by cyclin-dependent kinases regulates binding to PCNA

Replication factor C (RF-C) complex binds to DNA primers and loads PCNA onto DNA, thereby increasing the processivity of DNA polymerases. We have previously identified a distinct region, domain B, in the large subunit of human RF-C (RF-Cp145) which binds to PCNA. We show here that the functional interaction of RF-Cp145 with PCNA is regulated by cdk-cyclin kinases. Phosphorylation of either RF-Cp145 as a part of the RF-C complex or RF-Cp145 domain B by cdk-cyclin kinases inhibits their ability to bind PCNA. A cdk-cyclin phosphorylation site, Thr(506) in RF-Cp145, identified by mass spectrometry, is also phosphorylated in vivo. A Thr(506)→Ala RF-Cp145 domain B mutant is a poor in vitro substrate for cdk-cyclin kinase and, consequently, the ability of this mutant to bind PCNA was not suppressed by phosphorylation. By generating an antibody directed against phospho-Thr(506) in RF-Cp145, we demonstrate that phosphorylation of endogenous RF-Cp145 at Thr(506) is mediated by CDKs since it is abolished by treatment of cells with the cdk-cyclin inhibitor roscovitine. We have thus mapped an in vivo cdk-cyclin phosphorylation site within the PCNA binding domain of RF-Cp145