Toxine insecticide de Bacillus thuringiensis modifiée sensible à la pepsine

La présente invention concerne la dégradation des protéines Cry de Bacillus thuringiensis dans le tractus digestif des mammifères. Elle a pour objet des protéines Cry de Bacillus thuringiensis dont la séquence peptidique a été modifiée de manière à les rendre sensibles aux enzymes spécifiques du tractus digestif des mammifères, en particulier aux pepsines. Selon cette invention, les protéines Cry sont modifiées par insertion de sites de coupure par la pepsine dans leur séquence peptidique. L'invention concerne également des plantes transformées exprimant ces protéines Cry modifiées. (Résumé d'auteur

Interaction between functional domains of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins

Interactions among the three structural domains of Bacillus 1huringiensis Cn.l toxins %~ere investigated by functional analysis of chinieric proteins. Hybrid genes were prepared by exchanging the regions coding for either domain 1 or domain III among CrylAb, Cn,lAc, CrylC, and CrylE. The activity of the purified trypsinactivated chimeric toxins was evaluiated by testing their effects on the viability and plasma membrane permeability of Sf9 cells. Among the parental toxins, only CrylC was active against these cells and only chimeras possessing domain II from CrylC were functional. Combination of domain 1 from CrylE Niith domains Il and III from CrylC, however, resulted in an inactive toxin, indicating that domain II from an active toxin is necessary, but not sufficient, for activity. Pores formed by chimeric toxins in which domain I was frorn Cr31M or CrylAc were slightly smaller than those formed by toxins in which domain I was from CrylC. The properties of the pores formed by the chimeras are therefore likely to result froin an interaction between domain I and domain II or 111. Domain III appears to modulate the activity of the chimeric toxins: combination of domain 111 from CrylAb with domains 1 and II of CrylC gave a protein which was more strongly active than CrylC. (Résumé d'auteur

Development of Bacillus thuringiensis CryIC resistance by Spodoptera exigua (Huebner) (Lepidoptera : Noctuidae)

Selection of resistance in Spodoptera exigua (Hubner) to an HD-1 spore-crystal mixture, CryIC (HD-133) inclusion bodies, and trypsinized toxin from Bacillus thuringiensis' subsp, aizawai and B. thuringiensis subsp. entomocidus was attempted by using laboratory bioassays. No resistance to the HD-1 spore-crystal mixture could be achieved after 20 generations of selection. Significant levels of resistance (11-fold) to CryIC inclusion bodies expressed in Escherichia coli were observed after seven generations, Subsequent selection of the CryIC-resistant population with trypsinized CryIC toxin resulted, after 21 generations of CryIC selection, in a population of S. exigua that exhibited only 8% mortality at the highest toxin concentration tested (320 mu g/g), whereas the 50% lethal concentration was 4.30 mu g/g for the susceptible colony. Insects resistant to CryIC toxin from HD-133 also were resistant to trypsinized CryIA(b), CryIC from B. thuringiensis subsp. entomocidus, CryIE-CryIC fusion protein (G27), CryIH, and CryIIA. In vitro binding experiments with brush border membrane vesicles showed a twofold decrease in maximum CryIC binding, a fivefold difference in K-d, and no difference in the concentration of binding sites for the CryIC-resistant insects compared with those for the susceptible insects, Resistance to CryIC was significantly reduced by the addition of HD-1 spores, Resistance to the CryIC toxin was still observed 12 generations after CryIC selection was removed. These results suggest that, in S. exigua, resistance to a single protein is more likely to occur than resistance to spore crystal mixtures and that once resistance occurs, insects will be resistant to many other Cry proteins, These results have important implications for devising S. exigua resistance management strategies in the field

Etude des relations structure-fonction chez les endotoxines de Bacillus thuringiensis

Le travail réalisé durant cette thèse a été, dans un premier temps, consacré à l'étude des différentes possibilités d'expression et de production d'endotoxines modifiées et de protéines étrangères chez B. thuringiensis. Un premier système d'expression par fusion traductionnelle avec le gène cry1C, a été développé. L'expression d'un gêne d'inhibiteur de protéase végétal en fusion avec cry1C a été réalisée. L'étude de l'expression de gènes cry1C tronqués dans le domaine toxique a permis de montrer que les domaines de la protoxine étaient interdépendants, toute modification entraînant une perte de formation de corps d'inclusion et une diminution du taux de production. Ce phénomène a pu être partiellement compensé par l'emploi d'une molécule chaperon. Un deuxième système d'expression basé sur l'emploi d'un opéron contenant des gènes codant pour au moins une protéine chaperon a été étudié. Là encore, les possibilités d'expression de protéines étrangères sont très minces. L'expression dans ce système des gènes codant pour les protéines de 34 kDa et 40 kDa de la souche HnC a cependant permis de mettre en évidence un nouveau mécanisme de formation de corps d'inclusion nécessitant la coopération des deux protéines du cristal et leur traduction simultanée à partir d'un même ARN messager. Dans un second temps, le travail a été consacré à l'étude des interactions entre les différents domaines des endotoxines activées de B. thuringiensis afin de préciser le rôle de chacun des domaines dans le mode d'action au niveau de l'interaction avec la membrane cellulaire. Cette étude avait pour but de définir le degré d'indépendance des domaines et la nature des interactions éventuelles comme préalable à la modification des endotoxines par mutagenèse dirigée. Des protoxines Cry 1 hybrides ont été créées par échange de domaines en se basant sur la structure tridimensionnelle de Cry 1Aa afin de ne pas introduire de mutation dans les domaines. L'analyse des propriétés de ces protéines hybrides a été conduite au niveau de plusieurs étapes du mode d'action. Cette approche a permis de montrer que, au sein de l'endotoxine activée, les domaines fonctionnels responsables de l'accrochage sur les sites récepteurs et des effets cellulaires interagissent fortement. Une relation structure-fonction complexe existe chez les endotoxines de B. thuringiensis entre tous les domaines identifiés et ce à tous les niveaux, depuis la formation du corps d'inclusion chez la bactérie jusqu'aux différentes étapes du mode d'action des endotoxine

Managing insect resistance to plants producing Bacillus thuringiensis toxins

Insect-resistant transgenic plants have become an important tool for the protection of crops against insect pests. The acreage of insecticidal transgenic plants is expected to increase significantly in the near future. The bacterium Bacillus thuringiensis is currently the source of insecticidal proteins in commercial insect-resistant transgenic plants and will remain the most important source during the next decade. Insect resistance to B. thuringiensis Cry toxins is the main problem. Only one species, the diamondback moth, has evolved a resistance to B. thuringiensis-based formulations under field conditions. However, many other insect species were selected for resistance under laboratory conditions, indicating that there is a potential for evolution of resistance in most major pests. Many studies were conducted to elucidate the mode of action of the Cry toxins, the mechanisms and genetics of resistance, and the various factors influencing its development. This article reviews insect resistance to B. thuringiensis insecticidal proteins and related aspects, including the development of insect-resistant transgenic plants, B. thuringiensis toxins, their mode of action, mechanisms, stability, and genetics of resistance and management strategies for delaying resistance. (Résumé d'auteur

The crystal proteins from Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni display a synergistic activity against the codling moth, Cydia pomonella

Crystal proteins from Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni strain HnC are active against the codling moth, Cydia pomonella, a major pest of orchards. Inclusion bodies purified from strain HnC displayed an LC50 of 3.34 X 10-3 pg/p1. HnC-purified crystals were tenfold more active than Cry2Aa and Cry1Aa toxins, and 100-fold more toxic than Cry1Ab. The 34-kDa and 40-kDa proteins contained in HnC inclusion bodies were shown to act synergistically. The toxicity of crystal proteins produced by the recombinant B. thuringiensis strain BT-OP expressing the full-length native operon was about tenfold higher than that of the 34-kDa protein. When the gene encoding the non-insecticidal 40-kDa protein, which is not active, was introduced into the recombinant strain producing only the 34-kDa protein, the toxicity was raised tenfold and was similar to that of the strain BT-OP. (Résumé d'auteur