Overproduction of threonine by Saccharomyces cerevisiae mutants resistant to hydroxynorvaline

In this work, we isolated and characterized mutants that overproduce threonine from Saccharomyces cerevisiae. The mutants were selected for resistance to the threonine analog a-amino-13-hydroxynorvalerate (hydroxynorvaline), and, of these, the ones able to excrete threonine to the medium were chosen. The mutant strains produce between 15 and 30 times more threonine than the wild type does, and, to a lesser degree, they also accumulate isoleucine. Genetic and biochemical studies have revealed that the threonine overproduction is, in all cases studied, associated with the presence in the strain of a HOM3 allele coding for a mutant aspartate kinase that is totally or partially insensitive to feedback inhibition by threonine. This enzyme seems, therefore, to be crucial in the regulation of threonine biosynthesis in S. cerevisiae. The results obtained suggest that this strategy could be efficiently applied to the isolation of threonine-overproducing strains of yeasts other than S. cerevisiae, even those used industrially

Análisis genómico y transcriptómico de los efectores del sistema de secreción tipo III en Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335

Presentación oralLa especie Pseudomonas savastanoi pertenece al complejo Pseudomonas syringae, el cual está constituido por un conjunto de bacterias fitopatógenas Gram (-) de alto interés agrícola y económico. Dentro de esta especie se han descrito hasta la fecha cuatro patovares capaces de infectar huéspedes leñosos: pv. savastanoi (aislados de olivo), pv. nerii (aislados de adelfa), pv. fraxini (aislados de fresno) y pv. retacarpa (aislados de retama). La cepa NCPPB 3335 del patovar savastanoi (Psv), establecida como modelo para el estudio de la interacción de Pseudomonas patógenas con plantas leñosas, es el agente causal de la tuberculosis del olivo, enfermedad caracterizada por la aparición de tumores en las partes aéreas de la planta. Uno de los factores de patogenicidad de Psv más relevante es el sistema de secreción tipo III (T3SS) y su repertorio de efectores (T3E). La disponibilidad de la secuencia de Psv NCPPB 3335 nos ha permitido la predicción bioinformática de los genes que codifican su T3SS y su repertorio de T3E en base a la homología con otros efectores previamente descritos. Esta cepa presenta un repertorio de efectores constituido por 28 T3E. Con el objetivo de analizar la expresión del repertorio de T3E en Psv, se ha llevado a cabo un análisis RNAseq comparativo entre la cepa silvestre Psv NCPPB 3335 y un mutante de la misma del gen hrpL, el cual codifica un activador transcripcional de los genes del T3SS y de la mayoría de sus T3E. Las secuencias procedentes de este RNAseq se están analizando actualmente y los resultados que se obtengan del mismo nos permitirá no sólo analizar la expresión de los T3E que hemos identificado en esta cepa, sino también caracterizar el regulón HrpL completo en la misma y quizás identificar nuevos posibles T3E. Los resultados obtenidos, se compararán con una predicción de promotores regulados por HrpL (hrp-box), que se llevará a cabo utilizando una herramienta bioinformática generada por nuestro equipo.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Identificación bioinformática y análisis funcional de factores de transcripción de Pseudomonas savastanoi potencialmente implicados en la infección de Mandevilla spp.

La bacteria fitopatógena Pseudomonas savastanoi, perteneciente al complejo Pseudomonas syringae, incluye 4 patovares aislados de diferentes plantas leñosas: pv. savastanoi (olivo), pv. nerii (adelfa), pv. fraxini (fresno) y pv. retacarpa (retama). Recientemente, se ha caracterizado en nuestro grupo un nuevo patovar causante de necrosis bacteriana en la planta ornamental dipladenia (Mandevilla spp.) (Caballo-Ponce, E, 2017, Tesis Doctoral). Estudios filogenéticos han demostrado la estrecha relación entre cepas del patovar nerii (Psn) y las aisladas de Mandevilla spp. (Psm), sin embargo, éstas difieren en el rango de huésped. En este trabajo hemos llevado a cabo un análisis bioinformático comparativo del repertorio de posibles factores de transcripción codificados en los genomas de la cepa Ph3 de Psm y de las cepas de Psn ICMP16943 (capaz de infectar dipladenia y adelfa) y ESC23 (infecta solamente adelfa). De la comparativa bioinformática de un total de 500 posibles factores de transcripción, se han seleccionado 9 de ellos: 3 factores exclusivos de Psm Ph3, 2 factores truncados en Psm Ph3 y 4 factores ausentes en las cepas capaces de infectar dipladenia (Psn ICMP16943 y Psm Ph3). La ausencia/presencia o el truncamiento de los genes codificadores de estos factores se ha comprobado en estas y otras cepas de P. savastanoi mediante técnicas de PCR y secuenciación. Actualmente estamos llevando a cabo la construcción de mutantes en los factores seleccionados para determinar su papel en la infección de dipladenia. Este trabajo pretende contribuir en el conocimiento de los determinantes genéticos implicados en la especificidad de huésped de los diversos patovares de la especie P. savastanoi.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Identificación bioinformática y análisis funcional de factores de transcripción de Pseudomonas savastanoi potencialmente implicados en la infección de Mandevilla spp.

La bacteria fitopatógena Pseudomonas savastanoi, perteneciente al complejo Pseudomonas syringae, incluye cuatro patovares aislados de diferentes plantas leñosas: pv. savastanoi (olivo), pv. nerii (adelfa), pv. fraxini (fresno) y pv. retacarpa (retama). Recientemente, se ha caracterizado en nuestro grupo un nuevo patovar (Psm) causante de necrosis bacteriana en la planta ornamental dipladenia (Mandevilla spp.) (Caballo-Ponce, E, 2017, Tesis Doctoral). Estudios filogenéticos han demostrado la estrecha relación existente entre cepas del patovar nerii (Psn) y las aisladas de Mandevilla spp., aun cuando éstas difieren en el rango de huésped. En este trabajo hemos llevado a cabo un análisis bioinformático comparativo del repertorio de posibles factores de transcripción (Fts) codificados en los genomas de la cepa Ph3 de Psm y de las cepas de Psn ICMP16943 y ESC23. La búsqueda se centró en aquellos Fts posiblemente implicados en la infección de dipladenia, seleccionando un total de nueve posibles Fts: tres factores exclusivos de Psm Ph3, dos factores truncados exclusivamente en Psm Ph3 y cuatro factores ausentes tanto en Psn ICMP16943 como Psm Ph3 (las dos cepas que infectan dipladenia). De entre los TFs identificados, hemos seleccionados tres que forman parte de un posible operón junto a otros genes implicados en quimiotaxis. Se han construido mutantes de este operón en cada uno de los tres genes codificadores de los Fts seleccionados y en dos genes codificadores de Methyl Chemotaxis proteins (MCP). Actualmente estamos analizando el papel de estos genes en la patogenicidad en plantas de dipladenia y su implicación en quimiotaxis. Este trabajo pretende contribuir en el conocimiento de los determinantes genéticos implicados en la especificidad de huésped de los diversos patovares de la especie P. savastanoi.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Characterization of the GacS/GacA system in the virulence regulation in Pseudomonas savastanoi.

The two-component regulatory system GacS/GacA is one of the main mechanisms for global regulation in bacteria. GacS/GacA is a highly conserved system that has been studied in many pathogenic bacteria. However, its characterization has been mainly focused on pathogenic bacteria of herbaceous plants. Despite previous works have reported that GacS/GacA regulates the expression of virulence factors, its role in virulence varies among different species and strains. The aim of this work was the identification of virulence factors regulated by the GacS/GacA system in the model bacterium Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Psv), causal agent of olive knot disease. To this end, we generated a gacA deletion mutant in the strain Psv NCPPB 3335, whose transcriptomic profile was further analyzed using a massive RNA sequencing (RNA-seq) strategy. The bioinformatic analysis of RNA-seq data showed that the Psv GacS/GacA system regulates a large number of genes, including some virulence factors already described, such as those related to the type III secretion system, the biosynthesis of phytohormones and the catabolism of aromatic compounds, among others. In addition, small Rsm-type RNAs and regulatory proteins (RsmA) were identified in the regulatory cascade of the GacS/GacA system. Finally, the involvement of some of the virulence factors of Psv NCPP 3335 were further studied through different phenotypic assays, such as plant virulence assays, induction of hypersensitive response, leaf adhesion tests and translocation of type III effectors. Results obtained in this work indicate that GacS/GacA system presents a role in regulation of virulence factors of Psv NCPPB 3335.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Explorando el secretoma de Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi: Un enfoque bioinformático para el análisis de proteínas secretadas durante la interacción planta-patógeno

La tuberculosis del olivo, causada por Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Psv), se caracteriza por la formación de tumores en los troncos y ramas de las plantas infectadas. Las bacterias gramnegativas poseen mecanismos moleculares para la secreción de proteínas al espacio extracelular, si bien, las proteínas liberadas durante el proceso invasivo del patógeno han sido poco estudiadas. En este estudio hemos caracterizado el secretoma de la cepa Psv NCPPB 3335 y dos cepas mutantes en genes del T3SS, hrpA, codificante de la unidad estructural del pilus, y hrpL, proteína reguladora de los genes estructurales y los efectores. Utilizando espectrometría de masas y herramientas bioinformáticas hemos aislado e identificado el conjunto de proteínas secretadas al espacio extracelular en un medio de cultivo que simula las condiciones del apoplasto de la planta. De entre las detectadas, se seleccionaron aquellas con péptido señal para su secreción, descartando las que presentaban dominios hidrofóbicos y analizando posteriormente la localización de las proteínas seleccionadas a nivel subcelular. Con el conjunto de proteínas resultantes, el secretoma de Psv NCPPB 3335, se realizaron análisis para para visualizar las diferencias en la distribución de proteínas entre las distintas cepas utilizando diagramas de Venn, así como análisis de abundancia heatmap y STEM con los que definir posibles patrones entre ellas. Finalmente, las proteínas se caracterizaron funcionalmente utilizando diversos programas para la identificación de dominios funcionales. El enfoque bioinformático realizado, nos ha permitido analizar exhaustivamente el secretoma de Psv y dos mutantes del T3SS, identificando una gran cantidad de proteínas secretadas al espacio extracelular con independencia del T3SS. Este estudio proporciona nuevas perspectivas sobre flujos bioinformáticos dirigidos al análisis de proteínas secretadas en bacterias fitopatógenas y estudiar su papel en la interacción con el huésped vegetalUniversidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tec

Herramienta bioinformática para la identificación de motivos conservados en promotores bacterianos

Los factores de transcripción (FTs) son proteínas que se unen a secuencias específicas de ADN llamadas elementos reguladores, que se encuentran generalmente en las regiones promotoras de los genes. Al unirse a estos elementos, pueden activar o reprimir la transcripción génica. En el caso de FTs de amplio espectro, la identificación bioinformática de sus secuencias de unión en los promotores de un genoma permite predecir el conjunto de genes cuya regulación esté relacionada. Recientemente hemos desarrollado una herramienta bioinformática que permite el análisis y la búsqueda de motivos conservados en las regiones promotoras de los genes desregulados (DEGs) que se obtienen al llevar a cabo técnicas transcriptómicas como el RNAseq. Se trata de un flujo (pipeline) de scripts encadenados capaces de ejecutarse sucesivamente y de manera automatizada, gracias a un gestor de flujos desarrollado en la Unidad de Bioinformática de la Universidad de Málaga. El flujo usa como entrada listas de DEGs provenientes de experimentos llevados a cabo en una cepa bacteriana cuyo genoma esté secuenciado. El trabajo se ejecuta de forma paralela para cada una de las listas de DEGs. El primer paso consiste en la generación de un archivo de anotación de los genes de la lista a partir de un archivo de anotación del genoma de la bacteria. A partir del archivo de anotación, se obtiene otro archivo con las coordenadas genómicas de cada uno de los genes y se genera un archivo con las coordenadas de sus promotores, que sirven para obtener las secuencias de los genes y sus promotores en un archivo multifasta. A continuación, el flujo busca en las secuencias promotoras motivos almacenados en una base de datos de la propia plataforma. También permite la búsqueda de motivos de forma dirigida usando un archivo con matrices. Esta herramienta bioinformática está resultando de gran utilidad para la búsqueda de dominios conservados.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tec

El sistema de dos componentes GacS/GacA regula la expresión de factores de virulencia y patogenicidad en Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB3335.

GacS/GacA es uno de los principales sistemas de regulación global en bacterias gramnegativas. Trabajos previos realizados con bacterias patógenas de plantas herbáceas han descrito cómo el sistema GacS/GacA interviene en la regulación de diversos factores de virulencia. Sin embargo, la regulación de estos factores muestra variabilidad no solo entre especies, sino también entre cepas. En este trabajo, hemos estudiado el papel regulador del sistema GacS/GacA en la virulencia y patogenicidad de la cepa NCPPB 3335 de P. savastanoi pv. savastanoi (Psv), agente causal de la enfermedad conocida como tuberculosis del olivo. Para ello, se construyó un mutante por deleción del gen gacA, en la cepa Psv NCPPB3335, cuyo perfil transcriptómico se analizó globalmente mediante una estrategia de secuenciación masiva de ARN (RNA-seq). El análisis bioinformático de los datos de RNA-seq mostró que el sistema GacS/GacA de Psv regula la expresión de genes relacionados con el sistema de secreción tipo III (T3SS), la síntesis de auxinas, locomoción y quimiotaxis bacteriana, y la degradación de compuestos fenólicos asociada a la invasión de huéspedes leñosos. Además, se identificaron variaciones en los niveles de expresión de pequeños ARN de tipo Rsm y proteínas reguladoras (RsmA), elementos que intervienen en la cascada de regulación del sistema GacS/GacA. Con la intención de profundizar en la caracterización de este sistema, se han llevado a cabo ensayos fenotípicos complementantes, como ensayos de virulencia en plantas, inducción de respuesta hipersensible, sensibilidad a peróxido de hidrógeno y translocación de efectores tipo III.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Regulación de la biosíntesis de treonina en "Saccharomyces cerevisiae"

En esta Tesis se ha abordado el estudio de la regulación de la ruta biosintética de la Treonina en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Para ello se han utilizado dos estrategias diferentes: 1. Caracterización de algunas enzimas de esta ruta: Se ha puesto a punto un método para la medida de las actividades homoserina quinasa y aspartato quinasa. Se ha estudiado la variación de la velocidad inicial de ambas actividades con respecto a cada uno de sus sustratos. Para ambas enzimas se ha determinado el patrón de inhibición por aminoácidos relacionados con la ruta en cuestión. Únicamente la Treonina tiene un papel significativo en la regulación de ambas actividades enzimáticas, fundamentalmente sobre la aspartato quinasa. También se ha puesto a punto un método para la medida de la actividad Treonina sintetasa basado en la medida, mediante HPLC, de la producción de Treonina por un extracto crudo al que se ha añadido homoserina-fosfato. Esta actividad está determinada por el gen THR4. 2. aislamiento y caracterización de mutantes superproductores de Treonina: Mediante mutagénesis con nitrosoguanidina se han obtenido mutantes resistentes a hidroxinorvalina, un análogo toxico de la Treonina. Algunos de estos mutantes, además, excretan Treonina al medio de cultivo. Estos mutantes producen entre 15 y 30 veces más Treonina que las cepas silvestres y, aunque en menor grado superproducen también Isoleucina. En todas las cepas analizadas la superproduccion está asociada a la presencia de un alelo del gen HOM3 que determina una aspartato quinasa insensible a retroinhición por Treonina. Estos resultados, al igual que los anteriores indican que la aspartato quinasa es la enzima clave en la regulación de la biosíntesis de Treonina en Saccharomyces cerevisiae

Role of chemotaxis cluster II in pathogenic bacteria of woody and herbaceous plants.

Chemoreceptors are essential proteins able to detect environmental changes for bacterial adaptation to the environment. The genes encoding these proteins are found individually in the genome or forming clusters with other genes related to chemotaxis. In plant-pathogenic bacteria, about 82 thousand chemosensory sequences have been described (1). In the Pseudomonas syringae complex, one of the most important groups of plant-pathogenic bacteria, four chemotaxisrelated clusters have been described. However, one of these clusters, named cluster II, is absent in some bacteria of this complex infecting woody hosts of the Apocinaceae family. Examples of the absence of this cluster are strains of Pseudomonas savastanoi pv. mandevillae (Psm) and some strains of P. savastanoi pv. nerii (Psn), isolated from dipladenia (Mandevilla spp.) and oleander (Nerium oleander), respectively. Therefore, the aim of this work focuses on the functional characterization of cluster II, not only in bacteria isolated from woody hosts, but also in strains infecting herbaceous plants. First, we constructed knockout mutants of most genes encoded in cluster II, i.e. cheA, cheB, cheD, cheY and two genes coding for chemoreceptors in a woody plant pathogenic strain, both in Psn23 strain and in P. syringae pv. tomato (Pto) DC3000. Motility and virulence assays performed in oleander, dipladenia and tomato plants revealed that cluster II is involved in both phenotypes. In addition, bioinformatic analysis of the ligand-binding domain (LBD) (1) of the two chemoreceptors encoded in cluster II showed that only one of them has an LBD domain. To characterise this chemoreceptor in strain Psn23, capillarity chemotaxis assays are being performed, and its LBD domain has been purified. The purified domain will be used in protein-ligand interaction assays against a collection of plant-derived compounds.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech