Erzeugung und Charakterisierung eines Hepatoma-derived Growth Factor (HDGF) -defizienten Mausmodells

Der Hepatoma-derived growth factor (HDGF) bildet zusammen mit den ihm verwandten Proteinen (HRP-1-4 und LEDGF) eine Familie großer, proteinerger Wachstumsfaktoren. Aufgrund seiner ausgeprägten Expression während der Embryogenese verschiedener Organe, darunter Herz, Niere, Leber, Lunge, Darmtrakt und Gehirn, wird eine wichtige Funktion dieses Faktors während der normalen Entwicklung angenommen. Neben seiner initial identifizierten mitogenen Eigenschaften ist HDGF auch an der Modulation von Signalwegen des programmierten Zelltodes beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals eine transgene Mauslinie generiert, die defizient für HDGF ist. Mit deren Hilfe wurden die Auswirkungen der Inaktivierung von HDGF auf die normale Entwicklung der Maus charakterisiert und die in zahlreichen Studien beschriebene Bedeutung dieses Faktors auf Proliferation und Apoptose untersucht. Initial wurden Abschnitte des murinen HDGF-Gens mittels PCR amplifiziert und subkloniert. Unter Verwendung dieser Sequenzabschnitte des HDGF-Gens wurden zwei Austauschvektoren hergestellt, die (i) einen konstitutiven Reportergen-Knock-in mit verstärkt grün fluoreszierenden Protein (EGFP) sowie (ii) einen konditionalen Reportergen-Knock-in mit monomerem rot fluoreszierenden Protein (mRFP) ermöglichen sollten. Nach homologer Rekombination des konstitutiven Targeting-Vektors in murinen embryonalen Stammzellen und anschließender Blastozysten-Injektion wurden transgene Mäuse erhalten, in denen der Bereich von Exon 2 bis Exon 6 des HDGF-Gens durch die kodierende Sequenz von EGFP derart ersetzt wurde, dass anstelle von HDGF ein funktionelles Reporterfusionsprotein aus den ersten 31 Aminosäuren des HDGF-Proteins und EGFP (HATH1-31-EGFP) unter der Kontrolle des endogenen HDGF-Promotors exprimiert wurde. Analysen an diesen transgenen Mäusen zeigten, dass neben der Deletion von HDGF die Expression des HATH1-31-EGFP-Reporterproteins zur Lokalisation HDGF-exprimierender Organe in der Maus genutzt werden konnte. Durch direkten Nachweis des Reporterproteins HATH1-31-EGFP und nachfolgende immunhistochemische Analysen konnte im Auge eine Expression von HDGF in der Cornea, dem Linsenepithel und sowohl in der inneren als auch der äußeren Körnerzellschicht der Retina identifiziert werden. Interessanterweise war HDGF in den beiden Körnerzellschichten in unterschiedlichen Zellkompartimenten lokalisiert. Neben dem Auge zeigten distinkte Areale der Milz eine Expression von HATH1-31-EGFP. Diese Bereiche konnten der weissen Pulpa zugeordnet werden. Ausgehend von diesen neuen Erkenntnissen konnte HATH1-31-EGFP in peripheren CD3+, CD4+- und CD8+ T-Lymphozyten nachgewiesen werden. Unterschiede im CD4/CD8-Ratio, und daraus resultierende Auswirkungen der HDGF-Defizienz auf das Immunsystem, wurden nicht beobachtet. Detaillierte histologische Untersuchungen gaben entgegen den Ergebnissen verschiedener Studien keine Hinweise auf eine essentielle Rolle von HDGF während der Entwicklung verschiedener Organe. Darüber hinaus wurden in Verhaltenstests keine neurologischen Auffälligkeiten festgestellt. Auf Grundlage dieser Ergebnisse konnte erstmals mit Hilfe eines HDGF-defizienten Mausmodells gezeigt werden, dass die Entwicklung der defizienten Tiere ohne die Ausprägung eines offensichtlichen Phänotyps verläuft und HDGF für das normale Wachstum der Maus entbehrlich ist. In Zellkulturversuchen konnte schließlich an primären dermalen Fibroblasten der Beweis erbracht werden, dass der Verlust von endogenem HDGF keine Auswirkungen auf das Proliferationsvermögen, den Zellzyklus und die Sensitivität gegenüber exogen zugefügtem HDGF hatte. Ebenso reagierten primäre dermale Fibroblasten, denen HDGF per se fehlt, nicht empfindlicher gegenüber Apoptose induzierenden Stimuli oder oxidativem Stress

Overexpression of hepatoma-derived growth factor in melanocytes does not lead to oncogenic transformation

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>HDGF is a growth factor which is overexpressed in a wide range of tumors. Importantly, expression levels were identified as a prognostic marker in some types of cancer such as melanoma.</p> <p>Methods</p> <p>To investigate the presumed oncogenic/transforming capacity of HDGF, we generated transgenic mice overexpressing HDGF in melanocytes. These mice were bred with mice heterozygous for a defective copy of the Ink4a tumor suppressor gene and were exposed to UV light to increase the risk for tumor development both genetically and physiochemically. Mice were analyzed by immunohistochemistry and Western blotting. Furthermore, primary melanocytes were isolated from different strains created.</p> <p>Results</p> <p>Transgenic animals overexpressed HDGF in hair follicle melanocytes. Interestingly, primary melanocytes isolated from transgenic animals were not able to differentiate <it>in vitro </it>whereas cells isolated from wild type and HDGF-deficient animals were. Although, HDGF^-/-/Ink4a^+/-mice displayed an increased number of epidermoid cysts after exposure to UV light, no melanomas or premelanocytic alterations could be detected in this mouse model.</p> <p>Conclusions</p> <p>The results therefore provide no evidence that HDGF has a transforming capacity in tumor development. Our results in combination with previous findings point to a possible role in cell differentiation and suggest that HDGF promotes tumor progression after secondary upregulation and may represent another protein fitting into the concept of non-oncogene addiction of tumor tissue.</p