Molecular identification of wheat endoxylanase inhibitor TAXI-I11The nucleotide sequence reported in this paper is available at the EMBL/GenBank/DDBJ databases (accession number AJ438880)., member of a new class of plant proteins

AbstractTriticum aestivum endoxylanase inhibitors (TAXIs) are wheat proteins that inhibit family 11 endoxylanases commonly used in different (bio)technological processes. Here, we report on the identification of the TAXI-I gene which encodes a mature protein of 381 amino acids with a calculated molecular mass of 38.8 kDa. When expressed in Escherichia coli, the recombinant protein had the specificity and inhibitory activity of natural TAXI-I, providing conclusive evidence that the isolated gene encodes an endoxylanase inhibitor. Bioinformatical analysis indicated that no conserved domains nor motifs common to other known proteins are present. Sequence analysis revealed similarity with a glycoprotein of carrot and with gene families in Arabidopsis thaliana and rice, all with unknown functions. Our data indicate that TAXI-I belongs to a newly identified class of plant proteins for which a molecular function as glycoside hydrolase inhibitor can now be suggested

Molecular genetic analysis of taxi-type xylanase inhibitors in cereals

Granen vormen een belangrijk voedings- en voederbestanddeel. In tarwe en rogge hoofdzakelijk, en in gerst in mindere mate, is het niet-zetmeel celwandpolysacharide arabinoxylan de belangrijkste dieetvezelcomponent. Xylanase enzymen kunnen deze arabinoxylanketen intern splitsen. De isolatie en klassieke biochemische karakterisering van verschillende Triticum aestivum Xylanase Inhibitor (TAXI) eiwitten uit tarwemeel en van TAXI-achtige proteïnen uit extracten van andere graangewassen, introduceerde -naast enzyme en inhibitor- een derde interactiepartner die de efficiëntie van xylanases in biotechnologische toepassingen beïnvloedt en mogelijk een rol speelt in de afweermechanismen van de plant tegen aanvallen van celwanddegraderende xylanasen. Opgezuiverde TAXI-isovormen werden geclassificeerd als TAXI-I en TAXI-II op basis van van hun inhibitiepatroon ten opzichte van glycosyl hydrolase familie (GHF) 11 xylanasen, in het bijzonder op basis van hun mogelijkheid (TAXI-I) of onmogelijkheid (TAXI-II) om het xylanase van Aspergillus niger (ANX) te inhiberen.Het hier beschreven werk, behandelt de moleculair genetische analyse van de overeenkomstige Taxi-achtige genen in het genoom van verschillende graangewassen. Door gebruik te maken van een consensus-PCR strategie, werden in de eerste plaats verschillende kandidaat Taxi-achtige genen geïsoleerd in het tarwe-, gerst- en roggegenoom. Dit leverde het nodige basismateriaal voor een latere recombinante expressie van TAXI-type eiwitten en voor een in silico diversiteitsanalyse op basis van sequentiegelijkenissen met eerder gekarakteriseerde en publiek gemaakte proteïnen. Deze vergelijkende analyse suggereert dat TAXI-achtige eiwitten deel uitmaken van een superfamilie van glycosyl hydrolase-inhiberende eiwitten, betrokken in de reactie van de plant op biotische en abiotische stress.Recombinante expressie van de geïdentificeerde kandidaat Taxi-I, Taxi-II en Hvxi genen in Pichia pastoris of Escherichia coli, liet een eerste eiwitkarakterisering toe: de verwachte functionaliteit (inhibitie van xylanases) werd bevestigd en de specificiteit van deze inhibitie ten opzichte van verschillende xylanasen werd nagegaan voor recombinante TAXI-IA (rTAXI-IA), rTAXI-IB, rTAXI-IIA, rTAXI-IIB en rHVXI. Een vergelijkende sequentie-analyse van deze zeer gelijkende TAXI-sequenties met een anderzijds duidelijk verschillende inhibitiespecificiteit, in combinatie met informatie over de structurele basis van de ANX- en Bacillus subtilis xylanase (BSX)-inhibitie door TAXI-IA and TAXI-IIA, gaf een eerste aanwijzing voor een sleutelrol van Pro294 van TAXI-IIA en Gln376 van TAXI-IIB bij het bepalen van de gereduceerde inhibitie-activiteit ten opzichte van ANX. Single point mutanten rTAXI-IIA[P294L] en rTAXI-IIB[Q376H], die beiden de TAXI-I aminozuurcombinatie Leu/His hebben, bleken bovendien in staat om ANX te inhiberen. Deze resultaten toonden aan dat de TAXI-II inhibitiespecificiteit bepaald wordt door de identiteit van twee sleutelaminozuurresiduen op positie 294 en 376,betrokken bij de interactie met de -2glycon-subsite en de actieve site van GHF 11 xylanasen respectievelijk. Dit besluit liet ons toe om in geïdentificeerde TAXI coderende sequenties de residuen op te sporen die verantwoordelijk zijn voor inhibitie-aciviteit en -specificiteit.Aangezien er geen duidelijk morfologisch kenmerk geassocieerd is met het fenotype van Taxi-achtige genen, is het gebruik van deze bron van xylanase-inhibitoren via plantenveredeling afhankelijk van een fysische en genetische kartering en de ontwikkeling van een moleculaire merker genetisch verbonden aan de Taxi locus. De detectie van vier allelen in de Taxi-IA promoter regio liet toe om een geschikte merker te ontwikkelen gelinked aan het Taxi-IA gen. In silico identificatie van een genencluster van acht Taxi-achtige genen op rijst chromosoom 1, gevolgd door in kaart brengen op basis van de colineariteit tussen de graangewasgenomen, liet ons toe om de chromosomale locatie van de Taxi locus te voorspellen in de tarwe-rogge 3L/6L translocatiezone. Dat deze regio de Taxi locus herbergt, werd experimenteel bevestigd via een Taxi PCR-analyse op beschikbare aneuploïde genetische stocks. De exacte locatie van Taxi-IA op de longe arm van tarwe chromosoom 3B, genetisch verbonden aan specifieke merkers en kenmerken, werd uiteindelijk vastgelegd na genetische karteringsexperimenten in verschillende karteringspopulaties. De fysische kartering met behulp van een Taxi-IIB probe en tarwe-deletielijnen, bleek in overeenstemming met de genetische kartering resultaten en localiseerde Taxi-IIB in de distale regio op de lange arm van chromosoom 3D (in deletielijn regio 3DL3 0.81-7.00).De aanwezigheid van een genfamilie van Taxi-achtige genen op de lange arm van de groep 3 chromosomen van tarwe werd bevestigd op basis van een Southern analyse van het broodtarwegenoom met behulp van een Taxi probe. Een volledig beeld van de Taxi gen-biodiversiteit die een identificatie van meerdere genetische varianten en een karakterisering van de verschillende overeenkomstige isovormen beoogt werd bekomen met behulp van de ontrafeling van de familie van Taxi-achtige genen in het complexe hexaploide broodtarwegenoom. De screening van een T. aestivum BAC library (John Innes Center, Norwich, UK) met een Taxi probe gaf ons de mogelijkheid om grote tarwegenoominserts die één of meer Taxi-achtige genen of genfragmenten bevatten te isoleren. Twaalf verschillende BACs werden geïdentificeerd en vervolgens verder gekarakteriseerd via fingerprinting en sequentiebepaling. Fingerprinting met een Taxi probe maakte ons duidelijk welke BAC inserts overlappen en liet een schatting toe van het aantal Taxi-achtige genfragmenten op elk van deze inserts. Het in sequentie brengen van geamplificeerde genfragmenten en willekeurige sequentiereactie van het gehele insert van BAC 725L01, gevolgd door een assemblage en analyse van bekomen sequenties, bevestigde de sequentie van Taxi-IA and Taxi-IIB en leidde tot de identificatie van zes nieuwe volledige coderende sequenties, Taxi-725ACC, Taxi-725ACCN, Taxi-801NEW, Taxi-625OS, Taxi-725OS en Taxi-801OS, die allen sequentiekarakteristieken delen met de reeds eerder beschreven geïdentificeerde Taxi genen. De beschikbaarheid van verschillende Taxi-achtige genen uit het tarwegenoom, liet toe om de evolutionaire krachten die op specifieke regios van deze sequenties inwerken te analyseren. De evolutie van de sequentie die interfereert met de aglycon-bindingssite van het xylanase, werd gedreven door positieve, diversificerende krachten. Deze kunnen gezien worden als een respons van de plant op de wapenwedloop met het eveneens diversificerende microbiële xylanase. Negatieve, zuiverende selectie bleek daarentegen actief te zijn op een geconserveerde sequentieregio interagerend met de glycon-substraatbindingssite en op de regio interagerend met de actieve site van het xylanase. Hierbij werd nogmaals het functionele belang van deze sites, die de in dit werk geïdentificeerde determinanten voor de TAXI-II inhibitiespecificiteit bevatten, beklemtoond.De nucleotide- en overeenkomstige aminozuursequentiesimilariteit tussen de nieuwe geïdentificeerde Taxi-achtige genen, en het aldus het geconserveerde structuurmodel van de overeenkomstige TAXI-achtige eiwitten, wil niet noodzakelijk zeggen dat al deze eiwitten een inhibitie-activiteit vertonen. Op basis van de conservering van de in dit werk bediscussieerde structurele determinanten van interactie en inhibitiespecificiteit, kan gesuggereerd worden dat Taxi-725ACC, Taxi-725ACCN en Taxi-801NEW coderen voor xylanase inhibitoren. De analyse van de Taxi genfamilie die hier werd gepresenteerd op genoomschaal liet, naast de opheldering van de mogelijke orthologe en paraloge relaties tussen de verschillende leden van de Taxi-achtige genfamilie, ook toe om meer inzicht te krijgen in de functionele organisatie van deze genfamilie. Expressie-analyse op basis van beschikbare T. aestivum expressed sequence tag (EST)-data en genoomsequentiedata van in dit werk geïdentificeerde intergenische promoterregios, suggereert een differentiële, spatio-temporele genexpressie die leidt tot de produktie van verscheidene TAXI-achtige isovormen. EST-sequenties identiek aan de hier geïdentificeerde Taxi-achtige sequenties, werden teruggevonden voor bijna alle genen (met uitzondering voor Taxi-ACC en Taxi-801OS). In de eerste plaats werd hierdoor transcriptie vanaf deze genen bevestigd en kregen we een eerste inzicht in de bijhorende expressiecondities op basis van de beschikbare EST-databank gegevens. De aanwezigheid van identieke nucleotidesequentiefragmenten in geïdentificeerde genomische upstream -regios van verschillende Taxi genen, suggereert gemeenschappelijke promoterelementen en vergelijkbare regulatie van expressie. Zo identificeerde een voorlopige in silico promoteranalyse, elementen betrokken bij zaad- en embryospecifieke expressie in de upstream Taxi-IA en Taxi-ACCN sequentie. Een mogelijk specifieke expressie van deze genen in de graankorrel kon ook worden gesuggereerd op basis van de waargenomen, uitgesproken expressiecondities voor deze genen tijdens EST-analyse.status: publishe

Molecular identification and chromosomal localization of genes encoding Triticum aestivum xylanase inhibitor I-like proteins in cereals

TAXI (Triticum aestivum xylanase inhibitor) proteins are present in wheat flour and are known to inhibit glycosyl hydrolase family 11 endoxylanases, enzymes which are commonly applied in grain processing. Here, we describe the PCR-based molecular identification of genes encoding endoxylanase inhibitors HVXI and SCXI, the TAXI-like proteins from barley (Hordeum vulgare) and rye (Secale cereale) respectively. The HVXI coding sequence encodes a mature protein of 384 amino acids preceded by a 19 amino acid long signal sequence. SCXI-II/III has an open reading frame encoding a signal peptide of 21 amino acids and a mature protein of 375 amino acids. As for TAXI-I, no introns were detected in the untranslated regions and coding sequences identified. These newly identified sequences allowed us to perform a multiple sequence alignment with TAXI-I and similar proteins. Rice TAXI-type proteins clustered together with the cereal endoxylanase inhibitors. Dicotyledonous proteins with sequence similarity to TAXI-I, including the tomato xyloglucan-specific endoglucanase inhibiting protein, formed a different clade. The TAXI-type proteins may hence be part of a superfamily of proteins all involved in plant responses to biotic or abiotic stress and for which a function as glycosyl hydrolase inhibitors can be suggested. The chromosomal localization of the TAXI-I gene identified on wheat chromosome 3B, of the SCXI-II/III gene identified on rye chromosome 6R, and the presence of a cluster of TAXI-like genes on rice chromosome 1, allowed us to assign the location of TAXI-like genes to the wheat-rye translocation area 3BL/6RL characterized by RFLP markers XGlb33 and Xpsr454 and isozyme Est-5. In rice, RFLP marker C1310S corresponds to a TAXI-like protein encoding sequence.status: publishe

Identification of structural determinants for inhibition strength and specificity of wheat xylanase inhibitors TAXI-IA and TAXI-IIA

Triticum aestivum xylanase inhibitor ( TAXI)- type inhibitors are active against microbial xylanases from glycoside hydrolase family 11, but the inhibition strength and the specificity towards different xylanases differ between TAXI isoforms. Mutational and biochemical analyses of TAXI- I, TAXI- IIA and Bacillus subtilis xylanase A showed that inhibition strength and specificity depend on the identity of only a few key residues of inhibitor and xylanase [ Fierens K et al. ( 2005) FEBS J 272, 5872 - 5882; Raedschelders G et al. ( 2005) Biochem Biophys Res Commun 335, 512 - 522; Sorensen JF & Sibbesen O ( 2006) Protein Eng Des Sel 19, 205 - 210; Bourgois TM et al. ( 2007) J Biotechnol 130, 95 - 105]. Crystallographic analysis of the structures of TAXI- IA and TAXI- IIA in complex with glycoside hydrolase family 11 B. subtilis xylanase A now provides a substantial explanation for these observations and a detailed insight into the structural determinants for inhibition strength and specificity. Structures of the xylanase - inhibitor complexes show that inhibition is established by loop interactions with active- site residues and substrate- mimicking contacts in the binding subsites. The interaction of residues Leu292 of TAXI- IA and Pro294 of TAXI- IIA with the -2 glycon subsite of the xylanase is shown to be critical for both inhibition strength and specificity. Also, detailed analysis of the interaction interfaces of the complexes illustrates that the inhibition strength of TAXI is related to the presence of an aspartate or asparagine residue adjacent to the acid / base catalyst of the xylanase, and therefore to the pH optimum of the xylanase. The lower the pH optimum of the xylanase, the stronger will be the interaction between enzyme and inhibitor, and the stronger the resulting inhibition.status: publishe

Molecular identification of wheat endoxylanase inhibitor TAXI-I-1, member of a new class of plant proteins

Triticum aestivum endoxylanase inhibitors (TAXIS) are wheat proteins that inhibit family 11 endoxylanases commonly used in different (bio)technological processes. Here, we report on the identification of the TAXI-I gene which encodes a mature protein of 381 amino acids with a calculated molecular mass of 38.8 kDa. When expressed in Escherichia coli, the recombinant protein had the specificity and inhibitory activity of natural TAXI-I, providing conclusive evidence that the isolated gene encodes an endoxylanase inhibitor. Bioinformatical analysis indicated that no conserved domains nor motifs common to other known proteins are present. Sequence analysis revealed similarity with a glycoprotein of carrot and with gene families in Arabidopsis thaliana and rice, all with unknown functions. Our data indicate that TAXI-I belongs to a newly identified class of plant proteins for which a molecular function as glycoside hydrolase inhibitor can now be suggested. (C) 2003 Federation of European Biochemical Societies. Published by Elsevier Science B.V. All rights reserved.status: publishe

The cin quorum sensing locus of Rhizobium etli CNPAF512 affects growth and symbiotic nitrogen fixation

Rhizobium etli CNPAF512 produces an autoinducer that inhibits growth of Rhizobium leguminosarum bv. viciae 248 and activates the Agrobacterium tumefaciens tra reporter system. Production of this compound in R. etli is dependent on two genes, named cinR and cinI, postulated to code for a transcriptional regulator and an autoinducer synthase, respectively. NMR analysis of the purified molecule indicates that the R. etli autoinducer produced by CinI is a saturated long chain 3-hydroxy-acyl-homoserine lactone, abbreviated as 3OH-(slc)-HSL. Using cin-gusA fusions, expression of cinI and cinR was shown to be growth phase-dependent. Deletion analysis of the cinI promoter region indicates that a regulatory element negatively controls cinI expression. Mutational analysis revealed that expression of the cinI gene is positively regulated by the CinR/3OH-(slc)-HSL complex. Besides 3OH-(slc)-HSL, R. etli produces at least six other autoinducer molecules, for which the structures have not yet been revealed, and of which the synthesis requires the previously identified raiI and raiR genes. At least three different autoinducers, including a compound co-migrating with 3OH-(slc)-HSL, are produced in R. etli bacteroids isolated from bean nodules. This is further substantiated by the observation that cinI and cinR are both expressed under symbiotic conditions. Acetylene reduction activity of nodules induced by the cin mutants was reduced with 60-70% compared with wild-type nodules, indicating that the R. etli 3OH-(slc)-HSL is involved in the symbiotic process. This was further confirmed by transmission electron microscopy of nodules induced by the wild type and the cinI mutant. Symbiosomes carrying cinI mutant bacteroids did not fully differentiate compared with wild-type symbiosomes. Finally, it was observed that the cinR gene and raiR control growth of R. etli.status: publishe

Molecular identification of wheat endoxylanase inhibitor TAXI-II and the determinants of its inhibition specificity

Wheat grains contain Triticum aestivum xylanase inhibitor (TAXI) proteins which inhibit microbial xylanases, some of which are used in cereal based food industries. These inhibitors may play a role in plant defence. Among the TAXI isoforms described so far, TAXI-II displays a deviating inhibition specificity pattern. Here, we report on the molecular identity of TAXI-II and the basis of its inhibition specificity. Three candidate TAXI-II encoding sequences were isolated and recombinantly expressed in Pichia pastoris. To identify TAXI-II, the resulting proteins were tested against glycoside hydrolase family (GHF) 11 xylanases of Aspergillus niger (ANX) and Bacillus subtilis (BSX). One of these proteins (rTAXI-IB) inhibited both enzymes, like natural TAXI-I. The other candidates (rTAXI-IIA and rTAXI-IIB) showed an inhibition pattern typical for natural TAXI-II, only clearly inhibiting BSX. Comparative analysis of these highly similar sequences with distinct inhibition activity patterns, combined with information on the structural basis for ANX inhibition by TAXI-I [S. Sansen, C.J. De Ranter, K. Gebruers, K. Brijs, C.M. Courtin, J.A. Delcour, A. Rabijns, Structural basis for inhibition of Aspergillus niger xylanase by Triticum aestivum xylanase inhibitor-I, J. Biol. Chem. 279 (2004) 36022-36028], indicated a crucial role for Pro294 of TAXI-IIA and Gln376 of TAXI-IIB in determining the reduced inhibition activity towards ANX. Consequently, single point mutants rTAXI-IIA[P294L] and rTAXI-IIB[Q376H], both displaying the Leu/His combination corresponding to TAXI-I, were able to inhibit ANX. These results show that TAXI-II inhibition specificity bears on the identity of two key residues at positions 294 and 376, which are involved in the interaction at the -2 glycon subsite and the active site of GHF 11, respectively.status: publishe

Properties of TAXI-type endoxylanase inhibitors

Two types of proteinaceous endoxylanase inhibitors occur in different cereals, i.e. the TAXI [Triticum aestivum endoxylanase inhibitor]type and XIP [endoxylanase inhibiting protein]-type inhibitors. The present paper focuses on the TAXI-type proteins and deals with their structural characteristics and the identification, characterisation and heterologous expression of a TAXI gene from wheat. In addition, to shed light on the mechanism by which TAXI-type endoxylanase inhibitors work, the enzyme specificity, the optimal conditions for maximal inhibition activity, the molar complexation ratio and the inhibition kinetics of the inhibitors are explained and the effect of mutations of an endoxylanase on the inhibition by TAXIs is discussed. (C) 2003 Elsevier B.V. All rights reserved.status: publishe

Targeted molecular engineering of a family 11 endoxylanase to decrease its sensitivity towards Triticum aestivum endoxylanase inhibitor types

The Bacillus subtilis endoxylanase XynA (BSXY) is frequently used to improve the functionality of arabinoxylan-containing material in cereal based industries. The presence of endogenous Triticum aestivum xylanase inhibitors (TAXI-I and TAXI-II) in wheat is a real concern as they have a direct negative impact on the efficiency of this enzyme. Here, we used the recently determined structure of the complex between TAXI-I and an endoxylanase of Aspergillus niger to develop inhibitor-insensitive BSXY variants by site-directed mutagenesis of strategically chosen amino acids. We either induced steric hindrance to reject the inhibitors or interrupted key interactions with the inhibitors in the endoxylanase substrate-binding groove. The first strategy was successfully applied to position G12 where G12W combined inhibition insensitivity with unharmed catalytic performance. Variants from the second strategy showed altered inhibitor sensitivities concomitant with changes in enzyme activities and allowed to gain insight in the binding-mode of both TAXI-I and TAXI-II with BSXY.status: publishe