Mapeamento da variabilidade genética espontânea das cepas vacinais B19 E RB51 contra Brucella abortus, comercializadas no Brasil.

A brucelose é uma zoonose causada por bactérias intracelulares do gênero Brucella, que infectam humanos, animais domésticos e silvestres. Esta doença apresenta grande impacto econômico, devido à ocorrência de distúrbios reprodutivos nos animais. A prevenção contra infecções causadas por Brucella abortus em bovinos é feita por meio da administração das cepas vacinais B19 e RB51 de B. abortus. Existem relatos de que estas vacinas podem causar aborto às fêmeas vacinadas. Devido a isso, a vacinação de fêmeas jovens é preconizada. Entretanto, há diversos relatos na literatura de persistência da B19 no úbere, proporcionando a eliminação da bactéria pelo leite. Portanto, toda a ocorrência de aborto em animais vacinados, seja por B19 ou por RB51, merece um estudo aprofundado sobre a sua causa. Técnicas moleculares capazes de diferenciar cepas vacinais de cepas selvagens têm sido descritas. O gene ery, ligado ao catabolismo do eritritol, foi caracterizado como um importante marcador nessa diferenciação, por apresentar uma deleção espontânea de 702 pares de base na cepa B19. Como esta cepa é comercializada por diferentes empresas, estudos descreveram que algumas destas cepas comercializadas na Índia não apresentam essa deleção. No Brasil, não há registro sobre a origem das amostras B19 e RB51 utilizadas na confecção das vacinas comerciais, logo um estudo no sentido da verificação de possíveis mutações em relação à amostra padrão se faz necessário, devido a estas poderem reverter a sua virulência. Objetiva-se com este estudo caracterizar genotipicamente as cepas vacinais B19 e RB51 comercializadas no Brasil contra a brucelose bovina. A metodologia utilizada será a genotipagem de genes marcadores de virulência destas cepas vacinais, através da amplificação, sequenciamento e análises in silico das sequências obtidas. Os resultados obtidos permitirão a identificação do genótipo de todas as vacinas comerciais B19 e RB51 utilizadas para a imunização de bovinos no Brasil

Clonagem, purificação e avaliação da proteína PLDr de Corynebacterium pseudotuberculosis como marcador de infecção de ovinos e caprinos.

Trabalho 2

Produção e purificação de proteína recombinante de A. marginale e Babesia sp.

Comissão organizadora: Grácia Maria Soares Rosinha, Alexandra Rocha de Oliveir, Rodrigo Carvalho Alva

Avaliação dos genes gap, virB9 e virB12 de Brucella abortus como potenciais marcadores em teste sorológico para brucelose.

Objetiva-se, com este estudo, analisar as proteínas virB9, virB12 e GAPDH, como potenciais antígenos para diagnóstico da brucelose bovina. Para isto, as proteínas recombinantes serão produzidas via sistema de expressão heteróloga e testadas frente aos parâmetros de qualidade em ensaios de ELISA

Análise da variabilidade intra-espécie dos genes pld e rpoB de Corynebacterium pseudotuberculosis por meio de marcadores PCR-RFLP.

Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente etiológico da linfadenite caseosa em ovinos e caprinos, uma doença infectocontagiosa crônica caracterizada por abscessos em linfonodos superficiais ou internos. Os animais acometidos podem apresentar lesões internas ou externas, o que representa perdas econômicas graves na caprinovinocultura, como o comprometimento da produção de lã em ovinos, deficiência reprodutiva, condenação da carne ou morte do animal. Uma vez estabelecida a infecção no rebanho, torna-se difícil sua erradicação. Com o objetivo de avaliar a variabilidade genética intra-espécie em C. pseudotuberculosis, 31 isolados provenientes de seis municípios do Estado de Pernambuco, sendo 23 de caprinos e oito de ovinos, tiveram os seus DNAs genômicos extraídos e analisados por reação em cadeia da polimerase e análise de polimorfismos por tamanho de fragmentos de restrição (PCR-RFLP). Os locis escolhidos foram os genes pld e rpoB, cujas seqüências dos oligonucleotídeos amplificaram fragmentos de 924 e 447 pares de bases (pb), respectivamente. Os produtos da amplificação foram digeridos com as enzimas Pst I e Msp I (gene pld) e HpyCh4 IV e Msp I (gene rpoB). Os fragmentos de restrição foram corridos em gel de poliacrilamida a 15%, os quais foram corados com brometo de etídeo. Para o gene pld, digerido com a enzima Pst I, foram obtidos fragmentos de 566, 195, 91 e 72 pb; e com a enzima Msp I, fragmentos de 395, 369, 108 e 52 pb. O gene rpoB digerido com a enzima HpyCh4 IV apresentou fragmentos de 235, 126 e 86 pb; e com a enzima Msp I apresentou fragmentos de 222, 93, 78 e 54 pb. O padrão de bandas obtido para os 31 isolados de C. pseudotuberculosis, analisados neste estudo, foi monomórfico, não havendo, portanto, polimorfismo entre os diferentes isolados, independentes da espécie hospedeira ou da área geográfica estudada, o que corrobora com o padrão homogêneo da infecção para a região.bitstream/CNPGC-2009-09/12402/1/DOC167.pd

Clonagem e expressão heteróloga do gene pgk de Brucella abortus.

Trabalho 1

Identificação do gene pccB A partir da varredura de uma biblioteca genômica de Corynebacterium pseudotuberculosis visando uma vacina contra linfadenite caseosa.

Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente etiológico da linfadenite caseosa (LC), que acomete principalmente ovinos e caprinos. Esta doença é causadora de grandes problemas na ovinocaprinocultura. Diversas pesquisas tem sido realizadas na busca de uma vacina eficaz contra a LC. Estudos recentes utilizando um gene reporter em C. pseudotuberculosis, identificou a expressão do gene pccB (cadeia β da propionil CoA carboxilase) em macrófagos, indicando um possível envolvimento na virulência deste patógeno e um bom antígeno a ser explorado no desenvolvimento de uma nova estratégia vacinal. Como a sequência deste gene ainda não está disponível em banco de dados, o objetivo deste trabalho foi realizar varredura em uma biblioteca genômica de C. pseudotuberculosis para identificação completa da sequência do gene pccB. Uma sonda foi gerada a partir de um fragmento parcial do gene pccB marcado com [α32P]dCTP. A biblioteca genômica foi plaqueada em placas de lise para obter 2X103 pfu/placa e em seguida transferida para membranas de nylon previamente tratadas com soluções desnaturante, neutralizante e de pré-hibridização, a fim de, posteriormente, reagir com a sonda radioativa seguido da exposição das membranas a um filme de raio X. Dois clones positivos foram isolados e utilizados como template em reação de PCR, utilizando primers específicos da biblioteca genômica, gerando produtos de 3 Kb que foram sequenciados e analisados por BlastX, verificando-se 82% de identidade com o gene pccB2 de C. diphtheriae. Acreditando que haja sintenia entre as duas espécies mencionadas, foram desenhados primers com genes que flanqueiam o gene pccB2 de C. diphtheriae. Esses foram utilizados como iniciadores em reação de PCR, tendo como molde o DNA genômico de C. Pseudotuberculosis, gerando um fragmento de 2,1 Kb que foi clonado no vetor pGEM-T easy, sequenciado e analisado por BlastX. Resultados preliminares indicam que novos primers precisam ser desenhados para concluir a sequência deste gene