Hsf1 Activation Inhibits Rapamycin Resistance and TOR Signaling in Yeast Revealed by Combined Proteomic and Genetic Analysis

TOR kinases integrate environmental and nutritional signals to regulate cell growth in eukaryotic organisms. Here, we describe results from a study combining quantitative proteomics and comparative expression analysis in the budding yeast, S. cerevisiae, to gain insights into TOR function and regulation. We profiled protein abundance changes under conditions of TOR inhibition by rapamycin treatment, and compared this data to existing expression information for corresponding gene products measured under a variety of conditions in yeast. Among proteins showing abundance changes upon rapamycin treatment, almost 90% of them demonstrated homodirectional (i.e., in similar direction) transcriptomic changes under conditions of heat/oxidative stress. Because the known downstream responses regulated by Tor1/2 did not fully explain the extent of overlap between these two conditions, we tested for novel connections between the major regulators of heat/oxidative stress response and the TOR pathway. Specifically, we hypothesized that activation of regulator(s) of heat/oxidative stress responses phenocopied TOR inhibition and sought to identify these putative TOR inhibitor(s). Among the stress regulators tested, we found that cells (hsf1-R206S, F256S and ssa1-3 ssa2-2) constitutively activated for heat shock transcription factor 1, Hsf1, inhibited rapamycin resistance. Further analysis of the hsf1-R206S, F256S allele revealed that these cells also displayed multiple phenotypes consistent with reduced TOR signaling. Among the multiple Hsf1 targets elevated in hsf1-R206S, F256S cells, deletion of PIR3 and YRO2 suppressed the TOR-regulated phenotypes. In contrast to our observations in cells activated for Hsf1, constitutive activation of other regulators of heat/oxidative stress responses, such as Msn2/4 and Hyr1, did not inhibit TOR signaling. Thus, we propose that activated Hsf1 inhibits rapamycin resistance and TOR signaling via elevated expression of specific target genes in S. cerevisiae. Additionally, these results highlight the value of comparative expression analyses between large-scale proteomic and transcriptomic datasets to reveal new regulatory connections

DNA glycosylases: in DNA repair and beyond

The base excision repair machinery protects DNA in cells from the damaging effects of oxidation, alkylation, and deamination; it is specialized to fix single-base damage in the form of small chemical modifications. Base modifications can be mutagenic and/or cytotoxic, depending on how they interfere with the template function of the DNA during replication and transcription. DNA glycosylases play a key role in the elimination of such DNA lesions; they recognize and excise damaged bases, thereby initiating a repair process that restores the regular DNA structure with high accuracy. All glycosylases share a common mode of action for damage recognition; they flip bases out of the DNA helix into a selective active site pocket, the architecture of which permits a sensitive detection of even minor base irregularities. Within the past few years, it has become clear that nature has exploited this ability to read the chemical structure of DNA bases for purposes other than canonical DNA repair. DNA glycosylases have been brought into context with molecular processes relating to innate and adaptive immunity as well as to the control of DNA methylation and epigenetic stability. Here, we summarize the key structural and mechanistic features of DNA glycosylases with a special focus on the mammalian enzymes, and then review the evidence for the newly emerging biological functions beyond the protection of genome integrity

Le mécanisme de réparation par excision du 5-hydroxyméthyluracile dans l’ADN conduit à l’apoptose dans les lignées de fibroblastes de mammifère

Nous avons déjà démontré que la toxicité de la 5-hydroxyméthyl-2'- désoxyuridine (hmdUrd) envers les fibroblastes de hamster Chinois (cellules V79) résulte de l’excision d’un grand nombre de résidus d’hydroxyméthyluracile de l’ADN par l’enzyme hydroxyméthyluracile-DNA glysosylase. Nous montrons à présent que la mort des cellules V79 liée à ce mécanisme d’excision de la hmdUrd est du type apoptotique dans au moins 25% des cas. L’incubation des cellules V79 en présence de hmdUrd aboutit aux changements caractéristiques de l’apoptose mesurés par électrophorèse sur gel, cytométrie de flux et microscopie optique. Toutefois, hmdUrd ne provoque pas l’apoptose des cellules V79mutl qui ne possèdent pas de système de réparation par excision de la hmUra. L’électrophorèse en champ pulsé montre que le traitement par la hmdUrd aboutit la formation de fragments d’ADN double brin de haut poids moléculaire (2,2 Mb - 4,5 Mb) avant formation de l’échelle internucléosomale dans le cellules V79. L’analyse immunochimique montre que la protéine p53 est mutée dansles cellules V79 et V19mutl, indiquant que l’apoptose obtenue par un mécanisme de réparation par excision des bases de l’ADN est indépendante de l’action de p53. Ces résultats démontrent donc que l’apoptose secondaire à l’altération de l’ADN peut être la conséquence d’une activité de réparation de l’ADN

Formation et stabilité des photohydrates pyrimidiniques dans l’ADN

La photolyse ultraviolette (254 nm) de solutions aqueuses des copolymères poly(dC-dC) et poly(dA-dU) engendre lit formation d’hydrates pyrimidiniques. Il a été montré récemment que ce photoproduits étaient substrats de glycosylases bactériennes et de mammifères (Biochemistry. 28 : 6164, 1989). Une de ces enzymes de réparation, l’endonucléase III, a clé utilisée dans ce travail pour étudier la formation et la stabilité de cette importante classe de photoproduits pyrimidiniques dans les copolymères poly(dC-dC) et poly(dA-dU). L’irradiation du poly(dG-dC) à une dose de 100 kJ/m2 (254 nm) de lumière de l’ultraviolet lointain entraîne une conversion du résidu cytosyle en 2,2% d’hydrate de cytosine (hydroxy-6 dihydro-5,6 cytosine) et 0,09% d’hydrate d’uracile (hydroxy-6 dihydro-5,6 uracile). La stabilité des photohydrates pyrimidiniques a été étudiée en incubant les copolymères pendant une période de 24 heures à différentes températures après irradiation. L’hydrate de cytosine est stable lorsque la température est maintenue à 4°C. La stabilité de l’hydrate décroît avec l’augmentation de la température, la demi-vie étant de 75, 25 et 6 heures à des températures de 25°C, 37°C et 55°C respectivement. L’hydrate d’uracile dans le copolymère poly(dA-dU) irradié est stable à 4°C et à 25°C, et décroît avec une demi-vie de 6 heures à 37°C et de moins d’une demi-heure à 55°C. L’hydrate d’uracile et l’uracile ont été aussi détectés dans le poly(dG-dC) après une irradiation du copolymère. Une des conclusions majeures de ce travail est que l’hydrate de cytosine est relativement stable dans l’ADN à 37°C. De plus, lu décomposition de ce photoproduit s’effectue par désamination, conduisant à la formation de l’hydrate d’uracile. Ce dernier composé peut alors engendrer de l’uracile par déshydratation. La formation cl la stabilité des photohydrates pyrimidiniques dans l’ADN ont pu contribuer, au cours de l’évolution, au développement de diverses enzymes de réparation dont l’endonucléase III (et des activités enzymatiques analogues chez les organismes eucaryotes) et la glycosylase d’uracile

Formation, stabilité et réparation de modifications pyrimidiniques dans l'ADN

Les bases de l'ADN peuvent être endommagées par des agents oxydants incluant l'exposition à diverses sources de rayonnement. Les bases ainsi modifiées sont susceptibles d'être reconnues par des enzymes de réparation qui les excisent de l'ADN en créant des sites abasiques. Nous avons entrepris l'étude de trois classes de lésions : a) le glycol de thymine qui résulte de la saturation de la liaison éthylénique-5, 6, b) la 6-hydroxy-5, 6-dihydrouracile et la 6-hydroxy-5,6-dihydrocytosine qui sont obtenues par photohydratation, c) les dérivés 5-hydroxyméthylés de la thymine et de la 5-méthylcytosine formés par oxydation du groupement méthyle

CDA directs metabolism of epigenetic nucleosides revealing a therapeutic window in cancer

Cells require nucleotides to support DNA replication and repair damaged DNA. In addition to de novo synthesis, cells recycle nucleotides from the DNA of dying cells or from cellular material ingested through the diet. Salvaged nucleosides come with the complication that they can contain epigenetic modifications. Because epigenetic inheritance of DNA methylation mainly relies on copying of the modification pattern from parental strands1, 2, 3, random incorporation of pre-modified bases during replication could have profound implications for epigenome fidelity and yield adverse cellular phenotypes. Although the salvage mechanism of 5-methyl-2′deoxycytidine (5mdC) has been investigated before4, 5, 6, it remains unknown how cells deal with the recently identified oxidized forms of 5mdC: 5-hydroxymethyl-2′deoxycytidine (5hmdC), 5-formy-2′deoxycytidine (5fdC) and 5-carboxyl-2′deoxycytidine (5cadC)7, 8, 9, 10. Here we show that enzymes of the nucleotide salvage pathway display substrate selectivity, effectively protecting newly synthesized DNA from the incorporation of epigenetically modified forms of cytosine. Thus, cell lines and animals can tolerate high doses of these modified cytidines without any deleterious effects on physiology. Notably, by screening cancer cell lines for growth defects after exposure to 5hmdC, we unexpectedly identify a subset of cell lines in which 5hmdC or 5fdC administration leads to cell lethality. Using genomic approaches, we show that the susceptible cell lines overexpress cytidine deaminase (CDA). CDA converts 5hmdC and 5fdC into variants of uridine that are incorporated into DNA, resulting in accumulation of DNA damage, and ultimately, cell death. Our observations extend current knowledge of the nucleotide salvage pathway by revealing the metabolism of oxidized epigenetic bases, and suggest a new therapeutic option for cancers, such as pancreatic cancer, that have CDA overexpression and are resistant to treatment with other cytidine analogues11

SMUG1 is able to excise uracil from immunoglobulin genes: insight into mutation versus repair

Mammals harbour multiple enzymes capable of excising uracil from DNA, although their distinct physiological roles remain uncertain. One of them (UNG) plays a critical role in antibody gene diversification, as UNG deficiency alone is sufficient to perturb the process. Here, we show this unique requirement for UNG does not reflect the fact that other glycosylases are unable to access the U:G lesion. SMUG1, if overexpressed, can partially substitute for UNG to assist antibody diversification as judged by its effect on somatic hypermutation patterns (in both DT40 B cells and mice) as well as a restoration of isotype switching in SMUG-transgenic msh2(−/−)ung(−/−) mice. However, SMUG1 plays little natural role in antibody diversification because (i) it is diminishingly expressed during B-cell activation and (ii) even if overexpressed, SMUG1 more appears to favour conventional repair of the uracil lesion than assist diversification. The distinction between UNG and overexpressed SMUG1 regarding the balance between antibody diversification and non-mutagenic repair of the U:G lesion could reflect the association of UNG (but not SMUG1) with sites of DNA replication