Extraction protocols and chemical characterization of cell wall polysaccharide and intracellular polysaccharide from Streptococcus mutans biofilm

Streptococcus mutans é um dos microrganismos relacionados ao desenvolvimento da cárie dental, produzindo o biofilme, uma estrutura tridimensional complexa composta principalmente por polissacarídeos, que podem ser classificados como: i) polissacarídeos extracelulares, dispersos por toda a matriz, protegendo bactérias especialmente de compostos antimicrobianos; ii) polissacarídeos de parede celular contendo raminose (PRAM) ancorados ao peptidoglicano, essenciais para a virulência bacteriana e iii) polissacarídeos intracelulares (PIC), polímeros estocados no interior da célula, atuando como reserva energética. Em contraste com os polissacarídeos extracelulares, a determinação da estrutura química e o estabelecimento de um protocolo para a extração do PRAM e do PIC ainda é um desafio e não está estabelecida na literatura. Assim, considerando a importância biológica dos PRAM e dos PIC, o objetivo deste trabalho foi avaliar um protocolo de extração destes polímeros e suas características estruturais a partir de biofilme de S. mutans. Biofilmes de S. mutans UA159 foram formados em lâminas de vidro por 5 dias, sendo coletados e processados para a retirada da matriz microbiana, composta por polímeros extracelulares. As células bacterianas resultantes foram submetidas a parâmetro químico (extração alcalina a quente com NaOH 0,5M ou 1M por 5, 10 ou 15 minutos a 100 °C) ou físico (sonicação com 1 pulso de 15 s com potência de 5W ou 20W em água ou solução salina) para obtenção dos polissacarídeos de parede celular e dos polissacarídeos intracelulares. Após hidrólise ácida (ácido trifluoracético por 8 horas a 100 °C), a composição monossacarídica de todos os grupos experimentais foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência associada a detector de índice de refração, sendo o protocolo de extração com NaOH 1M a 100 °C por 15 minutos selecionado para a caracterização química das estruturas, utilizando-se ressonância magnética nuclear (RMN). Os resultados sugerem que enquanto o PIC é um polissacarídeo de glucanas com cadeia principal α-(1→4) ligado com cadeias laterais ramificadas α-(1→6), o PRAM é uma ramnoglucana com cadeia principal α-(1→2) e α-(1→3) de raminose e cadeias laterais de glucose ligadas por α-(1→2), sendo ambas as estruturas estudadas pela primeira vez em uma única fração. Assim, a partir de um único homogenato alcalino obtido de biofilme cariogênico foi possível esclarecer a estrutura química por RMN de duas moléculas: i) o polissacarídeo de parede celular, que pode ser a chave para o desenho de futuros alvos terapêuticos para antimicrobianos no futuro e ii) o polissacarídeo intracelular, que pode contribuir para um maior entendimento da rota metabólica de carboidratos em S. mutans.Streptococcus mutans is one of the microorganisms related to the development of dental caries, producing a biofilm, a complex three-dimensional structure composed mainly of polysaccharides, which can be classified as: i) extracellular polysaccharides, dispersed throughout the biofilm matrix, protecting bacteria especially from antimicrobial compounds; ii) rhamnose-containing cell wall polysaccharides (RHAP) anchored to peptidoglycan, essential for bacterial virulence and iii) intracellular polysaccharides (IPS), polymers stored inside the cell, acting as an energy reserve. In contrast to extracellular polysaccharides, the chemical structure and the protocol for the extraction of RHAP and IPS is not established in the literature. Thus, considering the biological importance of RHAP and IPS, we aimed to evaluate a protocol for extraction of these polymers and study their structural characteristics in S. mutans biofilm. For this, S. mutans UA159 biofilms were formed on glass slides for 5 days, and were collected and processed to remove the extracellular microbial matrix. The resulting bacterial cells were submitted to chemical (hot alkaline extraction with 0.5 M or 1 M NaOH for 5, 10 or 15 min at 100 °C) or physical (sonication with 1 pulse of 15 s with potency of 5W or 20W in water or saline solution) parameters to obtain the RHAP and IPS. After acid hydrolysis (trifluoracetic acid for 8 h at 100 °C), the monosaccharide composition of all experimental groups was determined by high performance liquid chromatography associated with a refractive index detector, and the extraction protocol with 1M NaOH, 15 min at 100 °C was selected for the chemical characterization of the structures using nuclear magnetic resonance (NMR). The results suggest that while IPS is a glucose polysaccharide with α-(1→4) main chain linked with α-(1→6) branched glucose side chains, RHAP is a rhamnoglucan with α-(1→2) and α-(1→3) rhamnose main chain and α-(1→2) glucose side chains. Both structures are being studied for the first time in a single fraction. Thus, a single alkaline homogenate obtained from cariogenic biofilm helped to clarify the chemical structure by NMR of two molecules: i) the cell wall polysaccharide, which may be key to the design of future therapeutic targets for antimicrobials and ii) the intracellular polysaccharide, which may contribute to a better understanding of the carbohydrate metabolic pathway in S. mutans

Evaluation of pathogenic biofilms: effect of a release system containing metronidazole

O perfil de liberação e o efeito de um sistema de liberação prolongada contendo metronidazol, antimicrobiano prescrevido para o tratamento da periodontite, foram avaliados na presença de biofilmes supra e subgengivais, representados respectivamente pelas bactérias Streptococcus mutans e Porphyromonas gingivalis. Os biofilmes foram crescidos e expostos ao sistema de liberação prolongada contendo metronidazol (MDZ) ou ao controle de veículo da formulação (CV), composto de monoglicerídeos e monoesterato de sorbitano. Biofilmes não tratados foram utilizados como controle negativo (CN). Os biofilmes e os meios de cultura de S. mutans foram coletados após a primeira exposição aos tratamentos nos tempos 24, 48, 72 e 96 horas enquanto para biofilmes de P. gingivalis os tempos foram 24, 48 e 72 horas. Após coleta, os biofilmes foram analisados em relação à quantificação de fármaco e viabilidade bacteriana (biofilmes de S. mutans: n=3; biofilmes de P. gingivalis: n=6). Biofilmes de S. mutans também foram avaliados em relação à acidogenicidade. Nos biofilmes supragengivais, a quantificação de MDZ nas primeiras 24 horas foi de 7% em relação à concentração inicial de fármaco na formulação, permanecendo em torno de 1% para os demais tempos. O teor de MDZ liberado da formulação reduziu a viabilidade bacteriana no tempo 24 horas e diminuiu a acidogenicidade dos biofilmes por 48 horas em relação aos grupos CV e NC (p0,05). O grupo CV apresentou menor viabilidade bacteriana se comparado ao grupo CN (p 0.05). The VC group presented lower number of viable bacteria than NC (p <0.05), however, it was higher when compared to the MDZ-treated group at all sampling times studied (p <0.05). In general, the controlled release system proposed in this study was able to prevent the proliferation of P. gingivalis biofilms and to destabilize S. mutans biofilms. In addition, microenvironments caused by biofilms interfered with the release kinetics of metronidazole, reducing its bioavailability. Thus, considering the continuity of the sub and supragingival biofilms, it is imperative to deepen the studies on formulations that can inhibit the formation of subgingival biofilms while destabilizing supragingival biofilms, thereby avoiding the rapid recolonization of the treated periodontal niches. In addition, the possibility of studying operational parameters for the development of pharmaceutical formulations using models of pathogenic biofilms can be considered in future studie

Pulsed LLLT improves tendon healing in rats: a biochemical, organizational, and functional evaluation

FAPESP - FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULOCNPQ - CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICOIn the last decades, the tendon injuries have increased substantially. Previous results suggested that low-level laser treatment (LLLT) promotes synthesis of extracellular matrix and improves the functional properties of the tendon. The aim of this study was to evaluate the effects of different protocols of LLLT on partially tenotomized tendons. Adult male rats were divided into the following: G1-intact, G2-injured, G3-injured + LLLT (4 J/cm(2) continuous), G4-injured + LLLT (4 J/cm(2) at 20 Hz). G2, G3, and G4 were euthanized 8 days after injury. G5-injured, G6-injured + LLLT (4 J/cm(2) continuous), and G7-injured + LLL (4 J/cm(2) at 20 Hz until the seventh day and 2 kHz from 8 to 14 days). G5, G6, and G7 were euthanized on the 15th day. Glycosaminoglycan (GAG) level was quantified by dimethylmethylene blue method and analyzed on agarose gel. Toluidine blue (TB) stain was used to observe metachromasy. CatWalk system was used to evaluate gait recovery. Collagen organization was analyzed by polarization microscopy. The GAG level increased in all transected groups, except G5. In G6 and G7, there was a significant increase in GAG in relation to G5. In G3 and G4, the presence of dermatan sulfate band was more prominent than G2. TB stains showed intense metachromasy in the treated groups. Birefringence analysis showed improvement in collagen organization in G7. The gait was significantly improved in G7. In conclusion, pulsed LLLT leads to increased organization of collagen bundles and improved gait recovery.In the last decades, the tendon injuries have increased substantially. Previous results suggested that low-level laser treatment (LLLT) promotes synthesis of extracellular matrix and improves the functional properties of the tendon. The aim of this study292805811FAPESP - FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULOCNPQ - CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICOFAPESP - FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULOCNPQ - CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO2010/52383-2sem informaçã