Generation of Flat and Curved Membranes by Inverse-BAR Domain Proteins

Biological membranes are tightly linked to the evolution of life, because they provide a way to concentrate molecules into partially closed compartments. The dynamic shaping of cellular membranes is essential for many physiological processes, including cell morphogenesis, motility, cytokinesis, endocytosis, and secretion. It is therefore essential to understand the structure of the membrane and recognize the players that directly sculpt the membrane and enable it to adopt different shapes. The actin cytoskeleton provides the force to push eukaryotic plasma membrane in order to form different protrusions or/and invaginations. It has now became evident that actin directly co-operates with many membrane sculptors, including BAR domain proteins, in these important events. However, the molecular mechanisms behind BAR domain function and the differences between the members of this large protein family remain largely unresolved. In this thesis, the structure and functions of the I-BAR domain family members IRSp53 and MIM were thoroughly analyzed. By using several methods such as electron microscopy and systematic mutagenesis, we showed that these I-BAR domain proteins bind to PI(4,5)P2-rich membranes, generate negative membrane curvature and are involved in the formation of plasma membrane protrusions in cells e.g. filopodia. Importantly, we characterized a novel member of the BAR-domain superfamily which we named Pinkbar. We revealed that Pinkbar is specifically expressed in kidney and epithelial cells, and it localizes to Rab13-positive vesicles in intestinal epithelial cells. Remarkably, we learned that the I-BAR domain of Pinkbar does not generate membrane curvature but instead stabilizes planar membranes. Based on structural, mutagenesis and biochemical work we present a model for the mechanism of the novel membrane deforming activity of Pinkbar. Collectively, this work describes the mechanism by which I-BAR domain proteins deform membranes and provides new information about the biological roles of these proteins. Intriguingly, this work also gives evidence that significant functional plasticity exists within the I-BAR domain family. I-BAR proteins can either generate negative membrane curvature or stabilize planar membrane sheets, depending on the specific structural properties of their I-BAR domains. The results presented in this thesis expand our knowledge on membrane sculpting mechanisms and shows for the first time how flat membranes can be generated in cells.Biologiset kalvot ympäröivät kaikkia soluja sekä mahdollistavat molekyylien eristämisen erillisiin osastoihin solun sisällä. Solukalvojen jatkuva ja hallittu muotoilu on välttämätöntä monien tärkeiden fysiologisten toimintojen varmistamiseksi. Solun jakautuminen, liikkuminen sekä ravintoaineiden ja solun pintareseptorien sisäänotto ovat kaikki esimerkkejä tapahtumista, jotka edellyttävät solukalvon muokkaamista. Tämän vuoksi on erittäin tärkeää ymmärtää solukalvojen rakennetta ja tunnistaa kaikki ne tekijät, jotka mahdollistavat tämän kalvojen muotojen sinfonian. Solu käyttää aktiinitukirangan synnyttämää voimaa liikuttaakseen solukalvoa eteenpäin muodostaen ulokkeita. Vaihtoehtoisesti solukalvon liike voi suuntautua kohti solun keskustaa, mikä mahdollistaa materiaalin sisäänoton. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että aktiini toimii yhdessä useiden solukalvoja muokkaavien proteiinien kanssa näissä tärkeissä tapahtumissa. Suurin kalvoja muokkaava proteiiniperhe on BAR-domeenin sisältävät proteiinit. Vaikka BAR-proteiineja on tutkittu paljon, niiden toiminnan mahdollistavia molekyylimekanismeja ei vielä juurikaan tunneta. Tämän väitöskirjan osatavoitteena oli analysoida I-BAR-proteiiniperheen jäsenten IRSp53:n ja MIM:n rakennetta ja toimintamalleja. Käyttämällä useita toisiaan tukevia menetelmiä (esim. elektronimikroskopia ja systemaattinen mutageneesi) pystyimme osoittamaan, että I-BAR-proteiinit sitovat PI(4,5)P2-lipidejä sisältäviä kalvoja, taivuttavat kalvoja negatiiviseen suuntaan ja ovat osallisena solukalvon sormimaisten ulokkeiden muodostuksessa. Väitöskirjani tärkein saavutus on uuden BAR-proteiinin Pinkbar:in biokemiallisten, rakenteellisten sekä fysiologisten ominaisuuksien kuvaaminen. Väitöskirjassa osoitetaan, että Pinkbar-proteiinia esiintyy merkittävästi munuaisen ja suoliston pintasolukossa (enterosyyteissä). Enterosyyteissä Pinkbar esiintyy usein yhdessä Rab13-proteiinia sisältävien vesikkeleiden kanssa. Poiketen muista tutkimistamme I-BAR-proteiineista, Pinkbar ei taivuta kalvoja vaan tukee niitä suorien rakenteiden muodostuksessa. Tässä väitöskirjassa esitän mallin siitä, miten oletamme Pinkbar-proteiinin muokkaavan solukalvoja. Tämä väitöskirjatyö kuvaa niitä mekanismeja joita I-BAR-proteiinit käyttävät muokatessaan solukalvoja, sekä antaa uutta tietoa näiden proteiinien biologisista tehtävistä. Lisäksi tämä työ esittää todisteita siitä, että I-BAR-proteiiniperheen sisällä on toiminnallisia ja rakenteellisia eroja. Tässä väitöskirjassa esitetyt tulokset laajentavat aiempaa käsitystämme solukalvojen muokkausmekanismeista, sekä esittävät ensimmäistä kertaa miten proteiini voi tukea suoria solukalvoja

Missing-in-metastasis and IRSp53 deform PI(4,5)P2-rich membranes by an inverse BAR domain–like mechanism

The actin cytoskeleton plays a fundamental role in various motile and morphogenetic processes involving membrane dynamics. We show that actin-binding proteins MIM (missing-in-metastasis) and IRSp53 directly bind PI(4,5)P2-rich membranes and deform them into tubular structures. This activity resides in the N-terminal IRSp53/MIM domain (IMD) of these proteins, which is structurally related to membrane-tubulating BAR (Bin/amphiphysin/Rvs) domains. We found that because of a difference in the geometry of the PI(4,5)P2-binding site, IMDs induce a membrane curvature opposite that of BAR domains and deform membranes by binding to the interior of the tubule. This explains why IMD proteins induce plasma membrane protrusions rather than invaginations. We also provide evidence that the membrane-deforming activity of IMDs, instead of the previously proposed F-actin–bundling or GTPase-binding activities, is critical for the induction of the filopodia/microspikes in cultured mammalian cells. Together, these data reveal that interplay between actin dynamics and a novel membrane-deformation activity promotes cell motility and morphogenesis

Molecular Mechanisms of Membrane Deformation by I-BAR Domain Proteins

SummaryBackgroundGeneration of membrane curvature is critical for the formation of plasma membrane protrusions and invaginations and for shaping intracellular organelles. Among the central regulators of membrane dynamics are the BAR superfamily domains, which deform membranes into tubular structures. In contrast to the relatively well characterized BAR and F-BAR domains that promote the formation of plasma membrane invaginations, I-BAR domains induce plasma membrane protrusions through a poorly understood mechanism.ResultsWe show that I-BAR domains induce strong PI(4,5)P2 clustering upon membrane binding, bend the membrane through electrostatic interactions, and remain dynamically associated with the inner leaflet of membrane tubules. Thus, I-BAR domains induce the formation of dynamic membrane protrusions to the opposite direction than do BAR and F-BAR domains. Strikingly, comparison of different I-BAR domains revealed that they deform PI(4,5)P2-rich membranes through distinct mechanisms. IRSp53 and IRTKS I-BARs bind membranes mainly through electrostatic interactions, whereas MIM and ABBA I-BARs additionally insert an amphipathic helix into the membrane bilayer, resulting in larger tubule diameter in vitro and more efficient filopodia formation in vivo. Furthermore, FRAP analysis revealed that whereas the mammalian I-BAR domains display dynamic association with filopodia, the C. elegans I-BAR domain forms relatively stable structures inside the plasma membrane protrusions.ConclusionsThese data define I-BAR domain as a functional member of the BAR domain superfamily and unravel the mechanisms by which I-BAR domains deform membranes to induce filopodia in cells. Furthermore, our work reveals unexpected divergence in the mechanisms by which evolutionarily distinct groups of I-BAR domains interact with PI(4,5)P2-rich membranes