Risultati di un test RFLP su ceppi vaccinali di Canine Distemper Virus in Italia

Canine Distemper (CD) is a highly contagious and multisystemic viral disease of domestic and wild carnivores. A published Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) test, based on the presence of a PsiI cleavage site on hemagglutinin (H) gene, allows a rapid differentiation of all currently used vaccine strains by virulent field strains. The present study describes the results of this test carried out on different CD vaccines available in Italy in 2010. RFLP has also revealed that the CD strain present in the Vanguard (Pfizer Animal Health) vaccine reacts as a wild-type strain. Moreover, genetic analysis of H gene sequence has showed that Vanguard vaccine strain does not cluster in the group of vaccine strains (America-1), as expected based on the product description provided by the manufacturer, but it is more closely related to wild-type strains of the America-2 group. However, this protocol shows significant advantages to identify CD wild-type strains

Ovine Catarrhal fever (bluetongue): Analysis of Culicoides species in seropositive farms

Bluetongue (BT) is an orbiviral disease of wild and domestic ruminants, mainly sheep. In Sicily, the first Bluetongue outbreak occurred in October 2000; there have been 76 recorded outbreaks so far. The National Surveillance Plan, based on European Union Commission Decision 138/2001/CE, establishes serological and entomological surveys. This plan consists of controls of seronegative cattle, called 'sentry' as indicators for the presence and circulation of virus in defined areas. To check the seroconversions, the regional territory has been subdivided in 400 km2 areas including 58 seronegative cattle, periodically checked by serological tests. All positive sera have been tested to detect the specific serotype by the National Reference Centre for Exotic Diseases (CESME) at the Istituto Zooprofilattico Sperimentale Abruzzo e Molise in Teramo (IZS Teramo). Moreover, entomological surveillance has been implemented in seropositive herds, to investigate the presence of insect vectors belonging to Culicoides genus. The goal of the present communication is to report on the different species of Culicoides found in the farms with Bluetongue virus and to investigate on the probable role of new competent vectors. This paper concerns data analysis of 581 light-trap catches collected in 321 farms from 2003 to 2008. We observed that 82% of checked farms were positive for Culicoides spp., and only 10% of the farms were positive for Culicoides imicola. © 2010 Blackwell Verlag GmbH

Quality controls for cell cultures: identification of interspecies cross-contamination by PCR-RFLP analysis of the cytochrome b gene

Cross-contaminations of a cell line with cells of different species represent a potential risk in laboratories handling human and animal cells. Therefore, it is necessary to control such contaminations. Tests based on mitochondrial DNA (mtDNA) are used in forensic analysis, phylogenetic studies and in food authentication. However, the use of mtDNA in quality controls of cell cultures is recent. Mitochondrial sequence differences of closely related animal species are five- to tenfold higher than those of nuclear genes. On the contrary, intraspecies variation in mitochondrial sequences is low in most animal species. Moreover, each cell contains 100–10.000 mitochondrial genomes. The amount of mtDNA is greater than nuclear DNA, so that mtDNA can be analyzed also from small or partially degraded samples. In the present study, a method based on a PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) analysis of the mitochondrial cytochrome b gene was used (2). This gene has some stable sequences which are recognized from universal primers and some variable sequences used for animal species identification by PCR-RFLP method

Analisi biomolecolare di ceppi di Canine Distemper Virus (CDV) in furetti domestici (Mustela putorius furo)

L\u2019agente eziologico del cimurro (CDV) appartiene alla famiglia Paramyxoviridae, genere Morbillivirus ed \ue8 causa di una patologia infettiva e contagiosa in canidi, mustelidi e procionidi. Gli Autori, descrivono un caso clinico di cimurro in due furetti domestici vaccinati con un ceppo Onderstepoort avianizzato. e la caratterizzazione biomolecolare del CDV isolato. I furetti presentavano un quadro clinico caratterizzato da dermatite pruriginosa e squamo-purulenta, alla regione del mento, peri-labiale, peri-vulvare ed al condotto uditivo esterno. I soggetti venivano a morte tre settimane dopo l\u2019esordio dei sintomi. I campioni di croste prelevati sono stati sottoposti ad estrazione degli acidi nucleici ed analizzati mediante RT-PCR per CDV. E\u2019 stata effettuata l\u2019analisi con enzimi di restrizione (RFLP-PCR) di conferma, per discriminare i ceppi vaccinali dai ceppi di campo. I prodotti di amplificazione sono stati purificati e sottoposti a sequenziamento. Le sequenze di 1823 nt del gene H del CDV sono state comparate mediante Clustal X con analoghe sequenze di ceppi di campo e ceppi vaccinali disponibili su GeneBank. Sulla base dei dati ottenuti le sequenze sono risultate appartenenti al lineage Europa, ben segregato dal lineage America-1, che raccoglie i principali ceppi vaccinali avianizzati, e differente dal cluster dei ceppi Rockborn-like. Il sequenziamento ha confermato il risultato ottenuto con la RFLP-PCR e la mancanza di relazione con il ceppo vaccinale inoculato. Le due sequenze ottenute, presentando un\u2019omologia nucleotidica elevata per ceppi isolati da cani in Italia, sono risultate differenti dal lineage Wildlife. Nel furetto l\u2019infezione da cimurro ha un esito fatale quasi nel 100% dei casi e viene controllata attraverso l\u2019uso di vaccini. Questo lavoro rappresenta un contributo alla esigua disponibilit\ue0 bibliografica in merito alle infezioni da CDV nei mustelidi ed implementa i dati disponibili sui ceppi virali circolanti. Il metodo diagnostico descritto rappresenta un sistema rapido e sensibile per la diagnosi dell\u2019infezione da cimurro

Canine Mesenchymal Stem Cells from visceral and subcutaneuous adipose tissue for cell-based therapy

This study compared some characteristics of canine Adipose tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells (cAD-MSCs) from subcutaneous and visceral fat. These findings were directed to obtain high quantity and quality cAD-MSCs for clinical cell-based therapy

Evidenza di un caso di epatite infettiva del cane in Sicilia

L’Adenovirus Canino di tipo 1 (CAV-1), appartenente al genere Mastadenovirus, famiglia Adenoviridae, è l’agente causale dell’epatite infettiva del cane (ICH). Il virus replica negli endoteli vascolari e negli epatociti, causando epatite necrotico emorragica acuta. I sintomi neurologici sono rari e sono causati da una vasculite del SNC. Negli ultimi anni, la diffusa vaccinazione ha ridotto la circolazione di CAV-1 ed i casi clinici segnalati sono diventati rari ed isolati. In questo lavoro, gli Autori descrivono un caso clinico in un cucciolo di 2 mesi, non vaccinato, con febbre, prostrazione, convulsioni, vomito, diarrea ed esito infausto in una settimana. A seguito dell’esame autoptico, sono stati prelevati campioni di vari organi (cuore, milza, polmone, rene, encefalo, fegato, intestino). Questi sono stati analizzati mediante PCR ed isolamento su colture cellulari sensibili, per la ricerca dei principali agenti virali causa di malattia nel cane: parvovirus, cimurro, CAV-1 e CAV-2, coronavirus, rotavirus. Tutti gli organi esaminati sono risultati positivi sia in PCR che all’isolamento su MDCK solo per CAV-1. Il genoma estratto è stato amplificato secondo la metodica descritta da Hu et al. (2001), in grado di discriminare CAV-1 da CAV-2. L’isolamento su MDCK ha prodotto effetto citopatico al secondo passaggio ed il virus isolato è stato identificato mediante immunofluorescenza diretta e PCR. Il presente lavoro costituisce un contributo alla esigua disponibilità bibliografica sulle infezioni da CAV-1. La vaccinazione sistematica condotta nell’ultimo decennio ha sensibilmente ridotto i casi di malattia. Infatti, gli ultimi casi risalgono al 2001 in Basilicata e Puglia dove sono stati descritti rispettivamente un caso di CAV-1 con sintomatologia classica ed un altro caratterizzato anche da sintomi neurologici. La presente indagine dimostra l’attuale circolazione di CAV-1 e la sporadica comparsa di casi clinici. La vaccinazione sistematica con CAV-2 rimane il mezzo più efficace di protezione della popolazione canina e costituisce l’unico metodo di controllo della malattia

Analisi filogenetica condotta su ceppi di Bovine Diarrhea Virus (BVDV) isolati in Sicilia

La Diarrea Virale del Bovino-Malattia delle Mucose, è una malattia infettiva che colpisce i bovini, ampiamente diffusa a livello mondiale. L’agente infettivo responsabile è un virus provvisto di envelope e con un genoma ad RNA a singolo filamento e a polarità positiva, appartenente al genere Pestivirus, famiglia Flaviviridae. A causa dell’elevata capacità di andare in contro a mutazioni genetiche, esistono numerose varianti di BVDV con diverso assetto antigenico e differente patogenicità. Ad oggi sono noti due genotipi: il BVDV-I e il BVDV-II. Il BVDV-I comprende almeno 13 sottotipi, mentre ne sono stati descritti solo 2 per il BVDV-II. Quest’ultimo, poco diffuso nel nostro territorio, è responsabile di una sindrome emorragica altamente letale. In Italia è stato isolato da bovini che erano stati trattati con vaccini anti-IBR contaminati. Recentemente è stata anche ipotizzata la presenza in Italia di una terza variante, il BVDV-III. L’infezione da BVDV spesso è associata con disordini a livello riproduttivo e nelle bovine gravide può esitare in aborto, malformazioni fetali o nascita di vitelli persistentemente infetti (PI). Scopo del presente lavoro è stato quello di genotipizzare i ceppi di BVDV isolati, al fine di approfondire la conoscenza circa la diffusione delle diverse varianti virali in Sicilia. Sono stati sequenziati ed analizzati filogeneticamente 18 ceppi, isolati su linee cellulari MDBK, da campioni di animali che erano risultati positivi in RT-PCR specifica per una porzione della regione 5’ UTR e in ELISA per la ricerca dell’antigene virale. Per il sequenziamento, i ceppi virali sono stati sottoposti ad estrazione dell’RNA ed amplificazione di una porzione della regione 5’ UTR, secondo quanto descritto da Vilcek et al. (1994). Le sequenze ottenute sono state successivamente allineate e comparate con altre sequenze di riferimento disponibili in GeneBank. L’analisi filogenetica condotta attraverso il metodo Neighbour-Joining, ha permesso di evidenziare la presenza di due sottotipi virali appartenenti al genotipo BVDV-I: BVDV-Ib e BVDV-Ie. Nessun ceppo virale è risultato appartenere al genotipo BVDV-II. Una successiva analisi di restrizione condotta sugli amplificati utilizzando l’enzima di restrizione AvaI, ha confermato infine l’origine bovina di ciascun isolato. L’analisi filogenetica dei ceppi virali isolati in un determinato territorio, rappresenta un valido strumento per il monitoraggio di una malattia infettiva, permettendo l’evidenziazione di nuove eventuali varianti causa di emergenze sanitarie, la realizzazione di test diagnostici specifici e la realizzazione di una profilassi vaccinale mirata

Nuove varianti di Bronchite Infettiva negli allevamenti avicoli siciliani

Avian Infectious Bronchitis (IB) is a disease caused by a Coronavirus, included in Coronaviridae family. The disease, endemic in Italy, affects both broilers and laying hens. It represents one of the main health issue in sicilian poultry farms. The presence of new antigenic variants makes problematic the implementation of an adequate prophylaxis through the use of appropriate vaccines. The present work aims to study the spread of IB strains in Sicily by serological and biomolecular tests in order to investigate the presence of "historical" strains as well as new strains and to carry out the genotyping of viruses isolated. The serological results show that the used vaccination protocols are able to develop an adequate antibody titre along all production steps both laying hens and broilers. The virological results underline the presence of QX strain in a broilers farm. This is a strain widespread in Italy but never reported in the regional territory