Differential requirements of aPKC activity within different epithelial tissues

Epithelial tissues are essential during morphogenesis and organogenesis. During development, epithelial tissues undergo several different remodeling processes, from cell intercalation to cell change shape. An epithelial cell has a highly polarized structure, which is important to maintain tissue integrity. The mechanisms that regulate and maintain apicobasal polarity and epithelial integrity are mostly conserved among all species and in different tissues within the same organism. aPKC-PAR complex localizes in the apical domain of polarized cells, and its function is essential for apicobasal polarization and epithelial integrity. In this work we characterized two novel alleles of aPKC: a temperature sensitive allele (aPKCTS), which has a point mutation on a kinase domain, and another allele with a point mutation on a highly conserved amino acid within the PB1 domain of aPKC (aPKCPB1). Analysis of the aPKCTS mutant phenotypes, lead us to propose that during development different epithelial tissues have differential requirements of aPKC activity. More specifically, our work suggests de novo formation of adherens junctions (AJs) is particularly sensitive to sub-optimal levels of apkc activity. Analysis of the aPKCPB1 allele, suggests that aPKC is likely to have an apical structural function mostly independent of its kinase activity. Altogether our work suggests that although loss of aPKC function is associated to similar epithelial phenotypes (e.g., loss of apicobasal polarization and epithelial integrity), the requirements of aPKC activity within these tissues are nevertheless likely to vary.As estruturas epiteliais são das mais abundantes num organismo multicelular. Duranteo desenvolvimento, os tecidos epiteliais são remodelados e passam por processos de morfogenese, servindo para compartimentalizar regiões corporais e formar estruturas durante a organogenese. No decurso destes processos, as células epiteliais sofrem rearranjos morfogeneticos, tanto na sua forma como propriedades adesivas. Estas alterações são altamente reguladas em termos espaço-temporais, e alguns exemplos são a constrição da zona apical e a intercalação celular (onde conjuntos de células se reorganizam para promover o alongamento do tecido num determinado eixo. Os mecanismos moleculares que regulam estes processos têm vindo a ser muito estudados, e muitos dos genes e proteínas envolvidos estão conservados desde levedura a humanos. As células epiteliais apresentam uma estrutura altamente polarizada, com um domínio apical e basal bem definidos e aos quais estão associados distintos complexos moleculares. Esta compartimentalização é uma das principais características das células epiteliais. Um dos complexos fundamentais na regulação da polarização celular é o complexo PAR-aPKC. Este complexo é constituído por uma cinase serina/treonina, a aPKC, cuja actividade de cinase é necessária para a localização e estabilização adequada de proteínas no domínio apical. Esta proteína é igualmente necessária para a exclusão, por fosforilação, de proteínas basais do domínio apical. A localização apical e a activação de aPKC são dependentes da interacção com PAR6. Bazooka (PAR3) também faz parte deste complexo e é fosforilada por aPKC. Esta fosforilação é importante para regular a localização das junções aderentes, e consequentemente a adesão intercelular. Estudos relizados em células MDCK e em Drosophila, mostram que a ausência de aPKC resulta na perca de estrutura epitelial em diversos contextos de desenvolvimento. No presente trabalho foram isolados dois novos alelos de aPKC, em Drosophila melanogaster. Um destes alelos apresenta fenotipos sensíveis á temperatura (aPKCTS). Clonagem e sequenciação dos mutantes revelam que a mutação se encontra no domínio de cinase. Analise estrutural da proteína sugere que esta mutação, juntamente com o aumento da temperatura, destabiliza a estrutura do domínio de cinase, o que indica que aPKCTS pode ser uma cinase-TS. O outro alelo isolado, aPKCPB1, possui uma mutação num aminoácido bastante conservado do domínio PB1, que se julga afectar a interacção entre esta proteína e PAR6. A análise de viabilidade dos dois novos mutantes isolados mostrou que o alelo aPKCPB1 é 100% letal, quer maternal quer zigoticamente, como os alelos já publicados para aPKC. O alelo aPKCTS é maternalmente 100% letal, independentemente da temperatura. Contudo, os fenótipos zigóticos de aPKCTS são dependentes da temperatura. Enquanto que à temperatura permissiva este alelo é 100% viável e os adultos não apresentam defeitos observáveis, à temperatura restritiva (30ºC), estas o mutante é 100% letal. Esta observação sugere que diferentes epitélios têm diferentes necessidades em relação à actividade de aPKC. Fenotipicamente, o mutante materno do alelo aPKCTS apresenta perca de estrutura epitelial durante a extensão da banda germinal, de acordo com o descrito para os allelos publicados da aPKC. Enquanto que todos os tecidos observados dos mutantes zigoticos (epitelio folicular, asas, abdómen) são fenotipicamente normais a temperaturas permissivas, a temperaturas restritivas são observados defeitos de encapsulamento dos cistoblastos pelo epitelio folicular durante a oogenese. Curiosamente, quando se remove uma cópia de aPKCTS, o epitelio folicular manifesta o mesmo fenotipo. Esta observação reforça a ideia que diferentes estruturas epiteliais poderão ter diferentes necessidades em relação à actividade de aPKC. Esta ideia é reforçada pelo aparecimento defeitos no fecho dorsal do abdómen adulto a temperaturas semi-restritivas. A análise dos estadios iniciais da oogenese sugere que algumas células precursoras do epitelio folicular falham a transição de mesenquimal para epitelial, enquanto que as que conseguem esta transição inicial, uma vez feita conseguem manter a estrutura epitelial. Todos estes resultados sugerem que há uma actividade intrínseca à aPKC que é particularmente importante durante processos que involvem a formação de novo junções aderentes entre células. Esta actividade não será tão limitante para a manutenção de uma identidade epitelial já estabelecida. Apesar destas observações, ainda não conseguimos comprender em promenor como é que o sistema está a ser afectado nestes mutantes. Como já mencionamos, alguns tecidos podem requerer mais actividade de aPKC para determinados processos, tais como a formação de novo de junções aderentes. Alternativamente, noutras fases do desenvolvimento e/ou noutros tecidos, a sua actividade pode não ser tão limitante, explicando assim os fenotipos observados. Por outro lado, estes requrimentos de actividade podem ser mais específicos, e o que é mais limitante é a fosforilação de um determinado substrato em diferentes contextos de desenvolvimento. Em relação ao alelo de aPKCPB1, a análise de clones no epitelio folicular, mostrou um fenótipo muito mais penetrante que o aPKCTS. Neste caso, nenhuma das células precursoras do epitelio folicular faz a transição de mesenquimal para epitelial, resultando num conjunto de células que envolvem a câmara ovárica sem qualquer organização epitelial. Adicionalmente, a proteína mutante de aPKCPB1 não se localiza apicalmente nas células da ectoderme embrionária, apesar de os seus níveis de expressão serem normais. Estas observações sugerem a localização apical da aPKC está associada a uma função estrutural, independente da sua função de cinase. No geral, o nosso trabalho sugere que, embora a perda da função de aPKC esteja associada a fenótipos epiteliais semelhantes (por exemplo, perda de polarização apicobasal e integridade epitelial), as exigências da atividade aPKC nestes tecidos, podem no entanto variar

Pre-mRNA splicing and regulation of gene expression after Drosophila egg fertilization

A expressão génica depende de uma coordenação complexa entre diferentes processos, os quais dependem de muitos e diferentes fatores de regulação. Devido a essa complexidade, espera-se que isso cause restrições nos estádios de desenvolvimento mais exigentes dos organismos, e vice-versa. Neste trabalho, tentamos explorar essas restrições e como influenciam a expressão genica, a relevância desses processos sob essas restrições e quão eficientes esses processos são para se adaptar sob esses estádios de desenvolvimento. Nesse sentido, decidimo-nos focar na expressão de genes zigóticos durante as rápidas divisões nucleares antes a transição da metade da blástula (MBT) do embrião de Drosophila, em que as curtas interfases limitam o tamanho dos genes aí expressos. Sabendo também que a mitose inibe no geral tanto a transcrição de genes como o seu splicing, e uma vez que a maioria dos genes expressos nesta fase não contem intrões, nós colocámos a hipótese de que provavelmente haveria também restrições no splicing nesse mesmo estádio de desenvolvimento. De acordo com essa hipótese, dois alelos mutantes para um fator de splicing nomeado fandango e homologo ao gene Xab2, uma das subunidades to complexo NTC/Prp19 em humano, foram isolados. Estes alelos apresentam defeitos na formação da blastoderme típicos de alelos mutantes de genes zigóticos. Ao analisar os transcritos expressos, reparamos que especificamente os genes zigoticamente expresses apresentavam defeitos de splicing, defeito esse, não observado nos genes transcritos maternalmente e depositados no embrião. Além disso, a expressão ectópica materna de um transcrito zigótico foi suficiente para suprimir seus defeitos de splicing no mutante de fandango. Por fim, um pequeno transcrito zigótico modificado de forma a conter múltiplos intrões apresentou mais defeitos de splicing quando expresso no embrião do tipo selvagem, comparativamente a sua expressão maternal. Mostrando assim, a existência de um pré-requisito de splicing altamente eficiente durante o estádio de desenvolvimento embrionário inicial em Drosophila. Apesar de 70% dos genes zigóticos expressos inicialmente serem curtos e não conterem intrões, a restante percentagem preserva intrões na sua arquitetura, sendo expressos durante um estádio critico para o processo de splicing. Desta forma, e uma vez que alguns destes intrões são bastante conservados entre espécies relativamente a sua posição, questionámo-nos se estes poderiam desempenhar alguma função relevante, nomeadamente durante a expressão do próprio gene. Para testar essa hipótese, fomos testar a possível funcionalidade de dois intrões conservados pertencentes a dois genes que são expressos antes da fase MBT e muito bem caracterizados: knirps (kni) e even-skipped (eve). Pare esse efeito, foram produzidas moscas transgênicas de Drosophila contendo inserções genómicas que possuíam o respetivo gene com ou sem intrão e respetivas regiões intergénicas reguladoras. Infelizmente, não foi possível obter moscas transgénicas do gene kni, não permitindo tirar uma conclusão sobre a função desse intrão nesse gene. Surpreendentemente, ambos o transgénico de eve com e sem intrão, suprimiram completamente o fenótipo de viabilidade do alelo mutante nulo do próprio gene. Além disso, não foram observadas alterações nos níveis transcritos gerados entre os dois casos, sugerindo assim não existir uma função para este intrão testado, pelo menos nas condições testadas. Para quantificar a eficiência de splicing em embriões de Drosophila, e ver se esta varia ao longo do desenvolvimento, tirámos partido da sequenciação dos transcritos em elongação nativa (dNET-seq). Esta técnica permite identificar a posição da RNA polimerase II (Pol II) com resolução de 1 nucleótido enquanto o gene esta a ser transcrito, e estabelecer a ligação dessa posição com a informação de splicing ocorrido no transcrito. Para tal foram isolados núcleos de embriões nos estádios correspondentes ao estádio MBT (early) e pós-MBT (late). A cromatina foi consequentemente digerida com Micrococcal nuclease (MNase) de modo solubilizar os complexos contento o DNA, e o RNA nascente ligado à Pol II. Estes complexos foram imunoprecipitados usando anticorpos específicos para os resíduos fosforilados, Serina 2 e Serina 5, do Domínio carboxi-terminal (CTD) de uma das subunidades da Pol II. Por consequente o RNA contido nesses complexos foi isolado, fracionado, e ligados especificamente a adaptadores de modo a garantir que unicamente os RNAs com grupo hidroxilo 3′ terminal fossem sequenciados. Desta forma foi possível observar sinal proveniente de genes zigóticos transcricionalmente ativos no embrião, enquanto que genes expressos maternalmente e depositados nos embriões, mas transcricionalmente inativos, não apresentaram sinal significativo. Mostrando assim, que o sinal detetado era especificamente proveniente de transcritos nascentes. Verificou-se também que a eficiência na terminação da transcrição estava associada à ausência de genes proximais a jusante ao gene analisado, e curiosamente, que genes pré-MBT apresentavam essas mesmas características. Enquanto que genes sem genes posicionados nos 500 pb a jusante, apresentavam pouca densidade de Pol II jusante ao sinal de terminação, genes convergentes que se sobrepõem exibiam mais Pol II a seguir a esse mesmo sinal, transcrição essa não correlacionada com a transcrição do gene convergente. Detetámos também reads abrangendo junções recursivas de splicing e entre exões em transcritos conectados ao local ativo das moléculas de Pol II posicionadas alguns nucleotídeos a jusante dos locais de splicing recursivos e canônicos 3′. Indicando que o splicing pode ocorrer logo após um local de splicing, ou seja, muito próximo do canal de saída da Pol II. Quantificando a eficiência de splicing com base no rácio entre reads spliced e reads totais detetados nos primeiros nos primeiros 100 nucleóticos a jusante do local de splicing 3′, foi possível correlacionar essa eficiência com algumas características. Entre essas características, tanto a força do sinal de splicing presente na sequência 3′, como o alto conteúdo em nucleotidos GC e o facto dos intrões não pertencerem nem à primeira nem às últimas posições, correlacionou-se com o facto de haver mais casos com evidencia de splicing imediato. Inesperadamente, enquanto bastantes intrões curtos apresentavam evidencias de splicing imediato, concordante com o mecanismo de splicing de definição de intrão, intrões muito longos, onde era esperado splicing por definição exonica também apresentaram muitos casos em que o splicing ocorrera antes da Pol II terminar a transcrição do exão. Esta observação, argumenta que a definição de exão não é obrigatória para splicing em metazoários. Por último, e além do aumento de densidade de Pol II observado na generalidade dos exões relativamente aos intrões, encontrámos ainda padrões especificos de pausa da Pol II associados aos diferentes níveis de eficiência de splicing, sugerindo um mecanismo acoplado de splicing que diminui o alongamento da transcrição. Tal como mostrado anteriormente em células humanas, dNET-seq foi capaz de detetar snRNAs pertencentes ao spliceosoma e productos intermediárias resultantes da primeira reação de splicing, mostrando uma vez mais que o spliceosoma se associa a Pol II ativa. Esses intermediários de splicicing juntamente com casos em que reads mostram a junção dos exões, permitiram concluir que 95% dos intrões analisados podem ser removidos cotranscricionalmente.Our aim is to explore the way developmental processes influence and are influenced by gene expression kinetics. We focused our work on Drosophila pre-midblastula transition (pre- MBT), during which the extremely fast syncytial nuclear divisions are known to impose significant constraints to transcription. Since most pre-MBT genes are intronless, we hypothesized significant constraints to splicing are also likely to occur. Accordingly, mutants for the spliceosome NineTeen complex (NTC) subunit Fandango impaired efficient splicing of pre-MBT but not maternally encoded transcripts. Furthermore, a small early zygotic transcript with multiple introns was poorly spliced in wild-type embryos, which suggests a developmental pre-requisite for highly efficient splicing during Drosophila early embryonic development. Although most pre-MBT genes are intronless, many patterning genes have evolutionary conserved introns. Given this conservation, we hypothesized that some of these introns are functionally relevant for the correct expression of these genes. Nevertheless, a large genomic construct containing an intron-deleted even-skipped (eve) transgene fully complemented the patterning defects of a eve null allele, suggesting no obvious functional requirement for this intron. In order to directly study splicing kinetics in a developing Drosophila embryo, we took advantage of the native elongating transcript sequencing (dNET-seq) to identify the position of RNA polymerase II when introns become spliced. Besides finding that most introns are cotranscriptionally spliced, we showed that in most cases this process occurs when Pol II is found paused few nucleotides past the 3′ss, which in your turn is associated to specific sequence and gene architecture features. Moreover, transcription termination efficiency was found to be associated to absence of proximal downstream genes, while genes with convergent genes show transcriptional-readthrough. Interestingly, pre-MBT genes were typically isolated and/or within large introns of other genes and splicing was typically immediate, which confirms a significant optimization of gene expression beyond small transcriptional unit size.SFRH/BD/109689/201