SufD - Bestandteil eines essentiellen plastidär lokalisierten Systems in Cyanobakterien, Cryptomonaden und höheren Pflanzen

Durch die vorliegende Arbeit konnte ein Beitrag zur funktionellen Charakterisierung des Nucleomorph-kodierten und plastidär lokalisierten Proteins ORF467 aus Guillardia theta geleistet werden. Dieses Protein konnte durch Sequenzhomologien als Bestandteil SufD des plastidären SUF-Systems identifiziert werden. Mit immunologischen Methoden konnte SufD in der Plastide von Guillardia theta nachgewiesen werden. Ein Gen für eine weitere Komponente des SUF-Systems, SufS, wurde durch die Auswertung von EST-Daten im Kerngenom lokalisiert. Die Cryptomonade Guillardia theta enthält damit ein über drei Genome, Kern, Plastide und Nucleomorph, verteiltes plastidäres SUF-System. Die heterogenomische Knock-out Mutation von SufD in Synechocystis führte zu einem Defekt der Zellteilung, der durch die Bildung von aus vier Zellen bestehenden Teilungsstadien gekennzeichnet war. In Importexperimenten mit radioaktivem Eisen wurde eine erhöhte Eisenaufnahme der SufD-Mutante gemessen. Die Analyse einer T-DNA Mutante des SufD-Homologen ATNAP6 in Arabidospis thaliana zeigte Defekte in der Embryonalentwicklung, eine veränderte Ultrastruktur der Chloroplasten, sowie ein reduziertes Wurzelwachstum und verringerten Chlorophyllgehalt der Pflanzen. Durch die in vivo Expression von GFP-Fusionsproteinen von ATNAP6 in Protoplasten konnte eine plastidäre Lokalisation von ATNAP6 nachgewiesen werden. Das Lokalisationsmuster zeigte eine Verteilung der GFP-Fluoreszenz in abgegrenzten subplastidären Bereichen, die für die subplastidäre Lokalisation notwendige beta-helikale Proteindomäne von ATNAP6 wurde durch die Generierung und in vivo Expression von modifizierten ATNAP6-GFP Fusionsproteinen identifiziert. In einer Expressionsanalyse mit einem Oligonukleotid-Genchip Microarray konnten signifikante Änderungen der Expression von regulativen Genen und von Genen in verschiedenen Stoffwechselwegen der ATNAP6 Knock-out Mutante gemessen werden. Die Expressionsdaten der ATNAP6 Knock-out Mutante und der komplexe Phänotyp von atnap6 konnten als Folge eines grundlegenden Defekts des plastidären SUF-Systems zur Synthese von Eisen-Schwefel Clustern interpretiert werden und ermöglichten es, ein Modell für die Funktion von ATNAP6 in Arabidopsis thaliana zu formulieren

Studien zum SELMA-Mechanismus

Diatomeen beherbergen eine komplexe Plastide rhodophytischen Ursprungs, vermutlich hervor-gegangen aus einer Endosymbiose höherer Ordnung (polyphyletisches Ereignis). Eine Rotalge wurde als Endosymbiont sukzessive zu einer semiautonomen komplexen Plastide mit vier Hüll-membranen etabliert. Anders als bei Crypto- und Chlorarachniophyta wurden essenzielle Sym-bionten-spezifische Gene vollständig ins Wirtsgenom in Heterokonto-, Haptophyta, Apicomplexa integriert und der frühere symbiontische Nukleus eliminiert. Die auf dem Wirts-Kern kodierten plastidären Präproteine bedurften der Etablierung neuer Translokationsmechanismen inklusive spezifischer Zielsteuerungssequenzen. Für die äußerste Plastidenmembran der komplexen „roten“ Plastiden wurde postuliert, dass die plastidären Präproteine über Sec61 ins Plastiden-Lumen (cER) transloziert werden. Der Transport entlang der zweiten Plastidenmembran (PPM) ist weitestge-hend ungeklärt. Es konnte gezeigt werden, dass der Transport plastidärer Präproteine anhand der Symbiont-specific ERAD-like machinery (SELMA) stattfinden kann. Für dieses aus der ER-assoziierten Degradation abgeleitete System wurden ERAD-Homologe identifiziert und teilweise spezifische Interaktionen gezeigt. SELMA stellt vermutlich ein während der Evolution rezykliertes und an neue Aufgaben adaptiertes System dar. Ein postulierter noch unbekannter Importrezeptor könnte als lösliches cER- oder als PPM-ständiges Protein plastidäre Präproteine im cER erkennen und an der zweiten Plastidenmembran für die weitere Translokation mittels SELMA-Komplex rek-rutieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden durch zwei gerichtete in silico Ansätze und einem proteinbio-chemischen Ansatz Kandidaten für den postulierten Importrezeptor gesucht und davon 32 eGFP-Fusionsproteine in der pennaten Diatomee Phaeodactylum tricornutum in vivo lokalisiert. Davon lokalisieren acht Fusionsproteine möglicherweise im sekretorischen Weg und drei weitere Kandi-daten mutmaßlich in den Mitochondrien. Zwei mutmaßlich PPM-lokalisierte, neun möglicher-weise cER lokalisierte Fusionsproteine und acht potenzielle PPC-Fusionsproteine wurden in dieser Arbeit identifiziert. Für zwei Kandidaten konnten eine PPC-Lokalisation in dieser Arbeit verifiziert werden. Ein möglicherer ER-Lumen-Rezeptor mit plastidärer Lokalisation wird als mutmaßlicher Importrezeptor im cER der komplexen Plastide postuliert. Für ein PPC-residentes TPR-Fusionsprotein wurden spezifische Interaktionen mit zwei mitochondrial carrier Proteinen der komplexen Plastide und dem in der zweiten Plastidenmembran-lokalisierten Protein sDer1-1 in vivo gezeigt

Experimentelle Ansätze zur Untersuchung spezifischer Prozessierung extrazytoplasmatischer Proteine durch drei allele Signalpeptidasen aus Bradyrhizobium japonicum

Aus Vorarbeiten mit ausgesuchten rekombinanten Klonen einer E-Tag Expressionsgen-Fusionsbank gingen mehrere Genunterbrechungsmutanten von B. japonicum hervor, die einen auffälligen symbiotischen Phänotyp aufwiesen. In drei voneinander verschiedenen methodischen Ansätzen wurde die Bedeutung von Genen für extrazytoplasmatische Proteine aus B. japonicum bei der Ausbildung einer effektiven Symbiose mit der Sojabohne (Glycine max) untersucht. Zum einen wurde durch ein spezifisches DNA-Amplifikationsverfahren der Nachweis erbracht, dass die untersuchten Stämme jeweils tatsächlich die vermuteten Manipulationen der betroffenen Genregionen aufwiesen. Zum zweiten wurde in dem Sonderfall der nex18-Genregion, die im B. japonicum Genom zwei Mal in identischer Form – jedoch an verschiedenen Positionen – vorliegt, eine Mutationsstrategie mit dem Ziel entwickelt, Einzel- und Doppelmutanten zu konstruieren. Das im Wurzelknöllchen (nodule) exprimierte Gen nex18 wurde zunächst in S. meliloti identifiziert und als bedeutsam für eine effektive Symbiose beschrieben. Die flankierenden Bereiche der entsprechenden Genregionen aus B. japonicum wurden amplifiziert und mit zentralen Resistenzkassetten (SmR bzw. KmR) ausgestattet. Durch zweifache homologe Rekombination wurde der intakte ORF bll5191 durch die Streptomycin-Resistenzkassette ersetzt. Das zweite Gen (blr2474) konnte bislang nicht durch eine entsprechend vorbereitete KmR-Kassette eliminiert werden. Die Klone der E-Tag Expressionsgenbank kodieren in der Regel für Proteine mit N terminalem Signalpeptid. Da in B. japonicum drei verschiedene Signalpeptidasegene existieren und Mutationen in diesen Genen sich unterschiedlich auf die Symbioseeigenschaften auswirken, sollte die Frage untersucht werden, ob und wie eine Substratspezifität zwischen den Signalpeptidasen und den noch zu prozessierenden Vorläuferproteinen ausgeprägt ist. Um einen möglichst großen Teil der E-Tag- Fusionsproteine aus B. japonicum in E. coli testen zu können, sollten genetisch stabile und definierte Stammderivate konstruiert werden, in denen jeweils eine der drei Signalpeptidasen aus B. japonicum die singuläre Leaderpetidase von E. coli ersetzt. Obwohl durch spezifische PCR-Technik und DNA-Sequenzierung gezeigt werden konnte, dass der Genaustausch wie erwünscht erfolgt ist, beweisen DNA-Hybridisierungen und PCR-Amplifikate, dass die Stammkonstrukte weiterhin eine intakte lepB Kopie beinhalten. Ob hier eine vollständige oder partielle Duplikation des Bakterienchromosoms vorliegt, bleibt zur Klärung durch weiterführende Experimente offen

Charakterisierung des Slr1649 aus Synechocystis sp. PCC 6803, ein Homolog zu Orf222 aus Guillardia theta

Von den auf dem Nukleomorph der Cryptophyte Guillardia theta codierten Proteinen besitzen 11 Homologien zu cyanobakteriellen Proteinen unbekannter Funktion. Durch die Charakterisierung dieser putativ Plastiden-lokalisierten Orfs können nicht nur die Funktion dieser Proteine entschlüsselt, sondern auch Einblicke in das komplexe Zusammenspiel der vier unterschiedlichen Genome von Guillardia theta gewonnen werden. Die Funktion des in dieser Arbeit untersuchten Orf222 wurde mit Hilfe eines im Modellsystems Synechocystis sp. PCC 6803 generierten homogenomischen knock-outs, aufgeklärt. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Homologe von Orf222 in Synechocystis, Slr1649, eine Phycocyanobilin-Lyase ist, welche spezifisch Phycocyanobilin an Position Cys155 der β-Untereinheit des Phycocyanins ligiert. Dabei scheint im Unterschied zu den meisten anderen Phycobilin-Lyasen nur Slr1649 an der Ligationsreaktion beteiligt zu sein. Homologe dieser Lyase findet man in vielen cyanobakteriellen, aber auch in einigen eukaryoten Organismen. In Cyanobakterien fällt eine Korrelation zwischen der Anzahl der Phycobiliproteine (ausgenommen Allophycocyanin) und der Anzahl der Slr1649 Homologen auf. Diese Homologen ließen sich in zwei Gruppen unterteilen. Die Slr1649-Gruppe ist für die spezifische Ligation von Phycocyanobilin an die β-Untereinheiten des Phycocyanins zuständig, während die Mitglieder der CpeT-Gruppe, zu der auch Orf222 gezählt werden kann, vermutlich die spezifische Ligation von Phycoerythrobilin an konservierten Cysteinen der Phycoerythrin β-Untereinheit bewirken. Es würde sich somit um Phycoerythrobilin-Lyasen handeln. Trotz der funktionellen Verwandtschaft unterscheiden sich beide Gruppen auf genomischer Ebene. Während die Gene der CpeT-Gruppe bezüglich des Gen-Locus einen weitgehend konservierten genomischen Kontext besitzen, sind die Gene der CpcT-Gruppe diesbezüglich sehr divergent. Neben der putativen Phycoerythrobilin-Lyase Orf222 (CpeT) wurde in einer EST-Bibliothek von Guillardia theta das Transkript einer weiteren putativen Phycoerythrobilin Lyase entdeckt, nämlich CpeZ. Das cpeZ Gen ist, im Unterschied zu Orf222, jedoch im Nukleus des Wirtes lokalisiert

Proteinkomponenten und Transportwege an der apikalen Membran polarer Epithelzellen

Polare Epithelzellen stellen einen essentiellen Baustein für die korrekte Funktion eines Organes dar. Sie bilden ein Monolayer an den Organaußengrenzen aus und stellen sowohl eine Barriere gegen, als auch ein Austauschsystem mit der Umwelt dar. Um diese speziellen Aufgaben wahrzunehmen, bedarf es einer geordneten und spezialisierten Aufteilung der Zytoplasmamembran. Die apikale Zytoplasmamembran ist dabei zur Außenwelt orientiert, während die basolaterale Zytoplasmamembran an benachbarte Zellen oder die Basallamina angrenzt. Für die Aufrechterhaltung dieser Polarität ist ein spezielles Protein- und Lipidsortiersystem nötig. Dabei sind bis dato zwei Grundlegende Proteinsortierplattformen bekannt. Zum einen handelt es sich um die Lipid-Raft-assoziierte Sortierung, bei der sich Proteine mit Vorlieben für solche Detergens-resistenten Membranmikrodomänen in diesen sammeln und als hochmolekulare Cluster zur Oberfläche transportiert werden. Zum anderen existiert ein Sortierweg, der auf der Bindung von Galectin-3 an die zu sortierenden Glykoproteine basiert. Auch in diesem Lipid-Raft-unabhängigen Weg bilden die beteiligten Proteine hochmolekulare Cluster. Zunächst wurde die Rolle der Alphakinase ALPK1 im Transport apikaler Proteine im Mäusedarm untersucht und eine Verwicklung in den Transport der Lipid-Raft-Proteine SI und DPP IV festgestellt. Im Hauptteil dieser Dissertation ging es um die Erweiterung des Verständnisses des Lipid-Raft-unabhängigen Proteinsortierweges. Insbesondere wurde festgestellt, dass für das vesikuläre post-TGN-Trafficking im Galectin-3-Sorting vermutlich keine Mantelproteine nötig sind, wohl aber ein Dynamin-ähnliches Protein involviert ist. Dabei handelt es sich um die große GTPase Mx1. Der knock-down dieses Proteins führte zu einer leicht reduzierten Transporteffizienz des von Galectin-3 sortierten Glykoproteins P75-GFP zur apikalen Zytoplasmamembran. Des Weiteren konnte durch Mx1 eine Verbindung zur unkonventionellen Sekretion von Galectin-3 gefunden werden. Durch siRNA-Experimente gegen Mx1 wurde festgestellt, dass dadurch die Sekretion von Galectin-3 abnahm. Interessanterweise scheint sekretiertes Galectin-3 für seine Wiederaufnahme in die Zelle eine Präferenz für Lipid-Rafts zu entwickeln, da gezeigt werden konnte, dass die Galectin-Endozytose in DRMs abläuft und durch einen Inhibitor der Lipid-Raft-abhängigen Endozytose gehemmt werden kann. Unter Zuhilfenahme der TIRF-Mikroskopie konnte die Oberfläche von MDCK-Zellen in bisher nicht gekannter Detailtreue abgebildet werden. Dabei konnten sowohl Mikrovilli, als auch dicht unter der apikalen Oberfläche befindliche Recycling-Endosomen detektiert werden, die möglicherweise als Sortierstation von Galectin-3 und P75-GFP dienen. Neben den Aufgaben von Galectin-3 bei der Epithelzellpolarisierung scheint dieses Lektin außerdem auch bei der Ausbildung von klarzelligen Nierenzellkarzinomen eine Rolle zu spielen. In einem Teilprojekt konnte gezeigt werden, dass Galectin-3 dort ein erhöhtes Expressionslevel aufweist und verstärkt mit β-Catenin interagiert. Zusammengefasst legen die in dieser Dissertation vorgelegten Studien nahe, dass das vielseitige und in der Entwicklung klarzelliger Nierenzellkarzinome beteiligte Protein Galectin-3 während seines Lebenszyklus, zu dem die Sortierung apikaler nicht mit Lipid-Rafts assoziierter Glykoproteine gehört, eine alternierende Präferenz für diese Detergens-resistenten Membranen aufzeigt und seine unkonventionelle Sekretion offensichtlich mit der Dynamin-ähnlichen GTPase Mx1 in Verbindung steht

Influence of the in vivo half-antibody exchange on the therapeutic efficacy of an IgG4 antibody-drug conjugate

A high number of therapeutic antibodies and their derivates e.g. antibody-drug conjugates (ADC) are under preclinical or clinical evaluation for the treatment of cancer. Most of those ADCs are based on the IgG1 or IgG4 subtype, depending on whether additional effector functions are desired or not. In contrast to IgG1, IgG4 is hardly capable to induce antibody-dependent cell-mediated or complement-dependent cytotoxicity and thus IgG4-based ADCs with cytotoxic payloads targeting only proliferating cells may have a preferred safety profile. Another unique property of the IgG4 subtype is the in vivo exchange of half-antibodies, resulting in random bispecific antibodies. BT062 (indatuximab ravtansine) is an ADC composed of an anti-CD138 IgG4 antibody conjugated to the highly cytotoxic maytansin derivate DM4. BT062 is currently evaluated in a clinical trial for the treatment of multiple myeloma. To investigate the influence of IgG4 half-antibody exchange on the functional properties and efficacy of ADCs, the following BT062 model antibodies mimicking the different process-derived antibody species were generated: (I) Wildtyp (WT) nBT062; (II) stable nBT062, comprising S228P and R409K mutations to prevent IgG4 shuffling in vivo; (III) half nBT062, serving as a model of the transistant state as C226S and C229S amino acid substitutions lead to the lack of covalent half antibody dimerization; and (IV) bispecific nBT062-natalizumab monovalently recognizing CD138 and CD49d antigens. All nBT062 variants were produced in FreeStyle CHO-S cells and purified by protein A affinity chromatography. Electrophoresis, western blotting and size exclusion chromatography were used to confirm the purification quality and provide first evidence on the aimed characteristics of each antibody due to the introduced mutations. In vitro analyses on NCI-H929 (CD138+/CD49d+), Ba/F3-hCD138 (CD138+/CD49d-) and Jurkat (CD138-/CD49d+) cells demonstrated nanomolar binding activities of all nBT062 variants towards CD138 followed by antigen-mediated internalization. After successful conjugation with model-corresponding quanities of DM4, resulting ADCs were investigated by an in vitro cytotoxicity assay. All nBT062-DM4 variants were capable to inhibit tumor cell proliferation by picomolar quanitities (IC50: ~80-460 pM). The MAXF 1322 xenograft mouse model was used to directly assess the influence of IgG4 shuffling in vivo. Bispecific nBT062-natalizumab-DM4 was the least potent model demonstrating only a boarderline efficacy even without the presense of human IgG4. WT nBT062-DM4, stable nBT062-DM4 and half nBT062 were highly effective against the tumor cells. At a low dosage, the efficacy of WT nBT062-DM4 and half nBT062-DM4 was reduced by the presence of human IgG4, while stable nBT062-DM4 was hardly affected. Analysis of mouse plasma samples confirmed the formation of bispecific antibodies out of WT nBT062-DM4 and half nBT062-DM4, but no half-antibody exchange was detected within samples of stable nBT062. These data clearly demonstrate an advantage of incorporating half-antibody exchange-preventing mutations into IgG4-based ADCs

SELMA - das ERAD-ähnliche Präproteintranslokationssystem der zweiten Plastidenmembran von Phaeodactylum tricornutum

Diatomeen spielen bei der globalen Kohlenstofffixierung eine maßgebliche Rolle und stellen als Hauptbestandteil des Phytoplanktons einen Großteil der marinen Biomasse dar. Wie viele andere Algengruppen, aber auch beispielsweise humanpathogene Organismen, wie der Malariaerreger P. falciparum, sind Diatomeen im Rahmen einer sekundären Endosymbiose entstanden, bei der eine Rotalge von einer eukaryoten Wirtszelle aufgenommen und zur komplexen Plastide reduziert wurde. Vergleichbar mit der Entstehung primärer Plastiden mussten in der Folge Transportmechanismen entwickelt werden, um Präproteine zurück in die Plastide über nun allerdings nicht zwei, sondern drei bzw. vier Membranen zu transportieren. Wie die Zelle dieses Problem mechanistisch gelöst hat, war lange Zeit unklar und wurde im Rahmen verschiedenster Modelle diskutiert. 2007 wurde auf theoretischer Basis postuliert, dass der Präproteintransport an der zweiten Plastidenmembran von Heterokontophyten, Haptophyten, Cryptophyten und Apikomplexen durch ein ERAD-ähnliches Transportsystem vermittelt wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnte diese Hypothese in der Diatomee P. tricornutum erstmals experimentell untermauert werden. Es wurde gezeigt, dass die symbiontenspezifischen ERAD-Faktoren sDer1-1 und sDer1-2 einen oligomeren Komplex in der zweiten Plastidenmembran bilden und mit den Transitpeptiden periplastidärer Präproteine interagieren. Der sDer1-Komplex spielt dabei als potentiell kanalbildende Komponente eine zentrale Rolle des symbiontenspezifischen ERAD-ähnlichen Systems SELMA. Zusätzlich findet am sDer1-Komplex eine Unterscheidung stromaler und periplastidärer Präproteine statt. So wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass Transitpeptide periplastidärer nicht aber stromaler Präproteine mit den Proteinen sDer1- 1 und sDer1-2 interagieren. Untersuchungen mit mutagenisierten Transitpeptiden zeigten zudem, dass alleine die +1 Position des Transitpeptids, besetzt mit einer aromatischen bzw. nicht-aromatischen Aminosäure, für diese Unterscheidung am sDer1-Komplex kritisch ist. Mit der symbiontenspezifischen Ubiquitin-Ligase s-E3 wurde ein Kandidat für ein weiteres Schlüsselelement von SELMA identifiziert. Im Ganzen zeigt sich damit, dass das symbiontenspezifische ERAD-Translokationssystem im Zuge der Endosymbiose von der ER-Membran in die zweite Plastidenmembran relokalisiert und zum Präproteintranslokator SELMA umfunktioniert wurde

Genetic compartmentalization in the complex plastid of Amphidinium carteraeand. The endomembrane system (ES) in Phaeodactylum tricornutum

Peridinin-containing dinoflagellates are important members of single-celled eukaryotic algae, which arose from an engulfment of an ancient red alga by a so far undefined host cell, a process called secondary endosymbiosis. Their plastids feature a unique membrane architecture and are surrounded by only three membranes. As the reduction of the endosymbiont’s genome and gene transfer from the plastid to the nucleus, the whole plastid genome was reorganized into minicircles coding for genes normally coded on the plastid genome. In order to isolate individual minicircles from one representative peridinin-containing dinoflagellate Amphidinium carterae CCAM0512 a novel transposon-based approach was carried out within this thesis. 89 minicircles were therefore isolated from A. carterae, 18 (20.2 %) are gene-containing minicircles, 71 (79.8 %) are empty minicircles. The 18 gene-containing minicircles are divided into three groups of minicircles, six single-gene minicircles, one two-genes minicircle and one three-genes minicircle. The 71 empty minicircles are divided into six groups. The characteristics of these minicircles and unique features were analyzed in this thesis. In contrast to previously reported organellar RNA editing in peridinin-containing dinoflagellates, no RNA editing was observed on transcripts of minicircles of A. carterae based on the analysis of coding genes. Additionally, the transcription of open reading frames was shown in so-called empty minicircles. Finally, based on the comparison with minicircles and rDNA sequences of three other A. carterae strains, it was speculated that minicircles undergo a rapid evolutionary diversification. The mechanisms of protein (e.g. vacuolar proteins) transport and sorting have been well-studied in plants, yeast and animals. However, little is known in the diatom P. tricornutum. In order to investigate the protein transport and sorting in P. tricornutum, essential marker proteins have to be established. In this work, the identification of marker proteins in the endomembrane system was based on a combination of in silico search for homologous proteins of P. tricornutum to proteins with known localizations in plants and subsequent in vivo localization studies in P. tricornutum. Several markers for different subcellular compartments were identified including the plasma membrane, two vacuolar-like structures, cER, hER, the nuclear envelope and the second outermost membrane of the complex plastid (PPM). Furthermore, the three parts of the Golgi apparatus and the cytosol could also be marked. These useful subcellular marker proteins are a very important prerequisite for studying the mechanisms of protein transport and sorting in P. tricornutum

Die Evolution des Proteinimports in die komplexen Plastiden der Chromalveolaten

Chromalveolaten sind eine komplexe Gruppe von heterogenen Protisten. Die phototrophen Vertreter und apicomplexen Parasiten weisen ein spezielles Organell – die komplexe Plastide – auf, die ihren Ursprung in einer ehemals freilebenden Rotalge findet. Diese Arbeit trägt maßgeblich zum Verständnis der Evolution des Präproteinimports in „rote“ komplexe Plastiden bei. (1) Es konnte demonstriert werden, dass E. huxleyi ein SELMA-System exprimiert und dieses somit in Cryptophyten, Heterokontophyten, Apicomplexen und Haptophyten existiert. Es wurde gezeigt, dass heterologe Lokalisationsstudien haptophytischer Sequenzen prinzipiell in P. tricornutum möglich sind. Phylogenetische Analysen anhand von h/sCdc48 und h/sUba1 deuten auf einen Rotalgenursprung von SELMA hin. Die ERAD-Sequenzen zeigen keine Monophylie der Wirte und widersprechen demzufolge der Chromalveolaten-Hypothese. (2) Die Identifikation der Deubiquininase ptDUP unterstützt die Annahme einer mechanistischen Konservierung des Transports via SELMA. ptDUP wurde als PPC-lokalisiert und in vitro funktionell nachgewiesen. Wahrscheinlich entfernt ptDUP die Ubiquitinmodifikationen an importierten SELMA-Substraten, was vermutlich für die Reifung und den weiteren Import von Präproteinen essentiell ist. (3) Nucleus-codierte plastidäre Proteine benötigen Zielsteuerungssignale zum plastidären Import. Hier wurde gezeigt, dass dieser in Diatomeen abhängig von positiven Ladungen ist. Diese kritischen Aminosäuren müssen nicht Teil des physikalischen Transitpeptids sein, sondern können auch N-terminal im maturen Protein vorliegen. Dadurch kann dieses den eigenen Import fördern. Das Resultat hat Implikationen für die Etablierung des Gentransfers. Die Akquirierung von Import-vermittelnden Präsequenzen könnte unter jenen Voraussetzungen leichter zu bewerkstelligen sein, da die Anforderungen an Transitpeptide vermindert werden. Transitpeptide, die nur in Verbindung mit dem maturen Protein Import vermitteln, könnten so als Importsignale rekrutiert worden sein, deren Funktionalität erst durch fortwährende Mutation evolviert ist