Caracterização molecular de estirpes de Mycobacterium tuberculosis resistentes à isoniazida e/ou rifampicina isoladas de amostras clínicas do estado de Santa Catarina

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em FarmáciaApesar dos avanços no desenvolvimento de antimicrobianos no século XX e início do século XXI, estima-se em 8,6 milhões o número de novos casos e 1,3 milhões de mortes causadas pelo bacilo da tuberculose em 2012 em todo o mundo. No Estado de Santa Catarina são notificados 1700 novos casos de tuberculose por ano (27 casos/100 mil habitantes), uma das menores incidências do Brasil. Porém, algumas cidades têm altos índices, próximos a 80 casos/100 mil habitantes. O estado de SC não possui dados moleculares das estirpes resistentes circulantes e a caracterização molecular desses isolados pode auxiliar no diagnóstico e controle da tuberculose no estado. O estudo incluiu 92 isolados de Mycobacterium tuberculosis resistentes à isoniazida e/ou rifampicina. Os isolados foram caracterizados pelo spoligotyping e MIRU e a detecção da resistência molecular foi avaliada pelo sequenciamento parcial dos genes associados à resistência para isoniazida (katG, inhA e ahpC) e à rifampicina (rpoB). Entre os 91 isolados resistentes à isoniazida, a mutação mais frequente foi a S315T no gene katG (64,8%). Apenas uma mutação foi encontrada no gene inhA (S94A) e 8 isolados resistentes continham mutações no gene ahpC. Em 23 isolados resistentes à isoniazida não foram encontradas mutações nos três genes relacionados. A mutação S531L do gene rpoB foi a mais prevalente entre os isolados resistentes à rifampicina (56,5%). Entre os 54 isolados resistentes à rifampicina apenas três não tinham mutações na região sequenciada. Nenhuma mutação foi encontrada nos isolados sensíveis e na estirpe H37Rv. Houve uma correlação positiva entre a mutação katG S315T e as estirpes da família LAM e do SIT 106. Por outro lado, foi encontrada uma correlação negativa entre essa mutação e a família T, indicando que nessa família algum outro mecanismo pode estar presente. Para a segunda mutação mais prevalente no gene rpoB (S531W), foi encontrada uma correlação positiva com a família LAM. O sequenciamento de outras regiões dos genes estudados e outros genes envolvidos com a resistência e a determinação da concentração inibitória mínima poderão contribuir para o entendimento dos mecanismos de resistência nos isolados onde não foram encontradas mutações. Estes achados são importantes para o desenvolvimento e aplicação de novos métodos de detecção de resistência de M. tuberculosis

Epidemiologia molecular e avaliação de testes laboratoriais para diagnóstico da tuberculose em amostras clínicas do hospital universitário Polydoro Ernani de São Thiago - HU/UFSC e desenvolvimento e otimização de um teste de PCR quantitativo para detecção de Mycobacterium tuberculosis

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2018A tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa causada por bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis. A cultura é o método padrão-ouro no diagnóstico laboratorial de TB, mas o resultado é obtido em até oito semanas em meio de cultura sólido e em até seis semanas em meio de cultura líquido. A baciloscopia apresenta resultado rápido, porém sua sensibilidade é baixa, especialmente na TB extrapulmonar. Uma boa alternativa é a utilização de testes moleculares, como por exemplo, o teste Xpert® MTB/RIF. Além disso, é importante o desenvolvimento de metodologias in house, que tornam o custo mais acessível. Este trabalho foi dividido em três capítulos experimentais (CE), sendo o CE-I um estudo descritivo retrospectivo para avaliação do teste Xpert® MTB/RIF em amostras de rotina do Hospital Universitário da UFSC, o CE-II um estudo descritivo prospectivo analisando os dados clínicos e epidemiológicos dos participantes, bem como a avaliação do teste Xpert® MTB/RIF em reação à cultura sólida e líquida e aplicação de metodologias de epidemiologia molecular diretamente de restos de reação do teste Xpert® MTB/RIF e o CE-III o desenvolvimento e a otimização de uma qPCR para diagnóstico da TB utilizando sondas de hidrólise. Na cultura líquida e na cultura sólida houve o crescimento de 17/19 e 18/19 amostras pulmonares e 3/4 e 4/4 amostras extrapulmonares de pacientes com TB. A tosse por mais de duas semanas, a perda de peso, a sudorese noturna e o contato prévio com pessoas com TB foram significativamente mais presentes em participantes com TB pulmonar (cultura positiva) do que em participantes sem TB pulmonar (cultura negativa). A sensibilidade da baciloscopia nas amostras pulmonares variou entre 70 e 80%, exceto para os participantes com TB prévia, onde foi obtido 100% se sensibilidade. Em amostras extrapulmonares a sensibilidade da baciloscopia foi baixa. Já o teste Xpert® MTB/RIF teve sensibilidade e especificidade acima de 95% em amostras pulmonares. Apesar da alta especificidade, a sensibilidade em amostras extrapulmonares do teste Xpert® MTB/RIF ficou próxima a 40%. Foi possível obter os perfis do MIRU-15 a partir do DNA genômico presente nos restos de reação em amostras que amplificaram no Xpert® MTB/RIF com Cq menor ou igual a 24, mas os perfis do spoligotyping foram obtidos com sucesso somente a partir do isolado clínico. A qPCR in house desenvolvido apresentou ótima performance analítica, especialmente nos limites de detecção, que foram de 4,7 cópias, 11,8 cópias e 23,6 cópias por reação, respectivamente para os alvos IS6110, IS1081 e senX3.Abstract : Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis complex bacteria. Culture is the gold standard method for laboratory diagnosis of TB, but it can take up to 8 weeks in solid medium and up to 6 weeks in liquid medium. Smear microscopy is a fast method, but its sensitivity is low, especially in extrapulmonary TB. A good alternative is the use of molecular tests, such as Xpert® MTB/RIF test. In addition, it is important to develop in-house methodologies that make the cost more affordable. This study was divided in three experimental chapters (CE): CE-I is a retrospective descriptive study for evaluation of the Xpert® MTB/RIF test in routine samples of the University Hospital of UFSC, CE-II is a prospective descriptive study that analyzes the clinical and epidemiological data of the participants, as well as the evaluation of the Xpert® MTB/RIF test in response to solid and liquid culture and application of molecular epidemiology methodologies directly to the reaction residues of Xpert® MTB/RIF test, and CE-III which shows the development and optimization of qPCR for diagnosis of TB using hydrolysis probes. In liquid and solid culture there was growth of 17/19 and 18/19 pulmonary samples and 3/4 and 4/4 extrapulmonary samples of patients with TB. Coughing for more than two weeks, weight loss, night sweats and previous contact with people with TB were significantly more prevalent in participants with pulmonary TB (positive culture) than in participants without pulmonary TB (negative culture). The sensitivity of the smear microscopy in pulmonary samples varied between 70 and 80%, except for the participants with previous TB, where 100% of sensitivity was obtained. The sensitivity of the smear microscopy was low in extrapulmonary samples. However, Xpert® MTB/RIF test had sensitivity and specificity above 95% in pulmonary samples. Despite the high specificity, sensitivity in extrapulmonary samples was close to 40% for Xpert® MTB/RIF test. It was possible to obtain MIRU-15 profiles from the genomic DNA present in the reaction residues in samples that amplified on Xpert® MTB/RIF with Cq less than or equal to 24, but the spoligotyping profiles were only successfully obtained from clinical isolate. The developed in-house qPCR presented excellent analytical performance, especially at detection limits, which were 4.7 copies, 11.8 copies and 23.6 copies per reaction, respectively for IS6110, IS1081 and senX3 targets

Performance of centralized versus decentralized tuberculosis treatment services in Southern Brazil, 2006–2015

Abstract Background Tuberculosis (TB) control programs face the challenges of decreasing incidence, mortality rates, and drug resistance while increasing treatment adherence. The Brazilian TB control program recommended the decentralization of patient care as a strategy for combating the disease. This study evaluated the performance of this policy in an area with high default rates, comparing epidemiological and operational indicators between two similar municipalities. Methods This study analyzed epidemiological and operational indicators on new cases of pulmonary tuberculosis reported in the Brazilian Notifiable Diseases Information System between 2006 and 2015. In addition, to characterize differences between the populations of the two studied municipalities, a prospective cohort study was conducted between 2014 and 2015, in which patients with new cases of culture-confirmed pulmonary tuberculosis were interviewed and monitored until the disease outcome. A descriptive analysis, the chi-square test, and a Poisson regression model were employed to compare TB treatment outcomes and health care indicators between the municipalities. Results Two thousand three hundred nine cases were evaluated, of which 207 patients were interviewed. Over the 2006–2015 period, TB incidence per 100,000 population in the municipality with decentralized care was significantly higher (39%, 95% CI 27–49%) in comparison to that of the municipality with centralized care. TB treatment default rate (45%, 95% CI 12–90%) was also higher in the municipality with decentralized care. During the two-year follow-up, significant differences were found between patients in centralized care and those in decentralized care regarding treatment success (84.5 vs. 66.1%), treatment default (10.7 vs. 25.8%), illicit drug use (27.7 vs. 45.9%), and homelessness (3.6 vs. 12.9%). The operational indicators revealed that the proportion of control smear tests, medical imaging, and HIV tests were all significantly higher in the centralized care. However, a significantly higher proportion of patients started treatment in the early stages of the disease in the municipality with decentralized care. Conclusions These data showed a low success rate in TB treatment in both municipalities. Decentralization of TB care, alone, did not improve the main epidemiological and operational indicators related to disease control when compared to centralized care. Full implementation of strategies already recommended is needed to improve TB treatment success rates

Molecular profiling of drug resistant isolates of Mycobacterium tuberculosis in the state of Santa Catarina, southern Brazil.

Submitted by Nuzia Santos ([email protected]) on 2016-02-22T18:00:26Z No. of bitstreams: 1 Molecular profiling of drug resistant isolates of Mycobacterium tuberculosis in the state of Santa Catarina, southern Brazil..pdf: 292609 bytes, checksum: 4bea0aaa468b44fe8ec1bba4d8017a9e (MD5)Approved for entry into archive by Nuzia Santos ([email protected]) on 2016-02-22T18:06:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Molecular profiling of drug resistant isolates of Mycobacterium tuberculosis in the state of Santa Catarina, southern Brazil..pdf: 292609 bytes, checksum: 4bea0aaa468b44fe8ec1bba4d8017a9e (MD5)Made available in DSpace on 2016-02-22T18:06:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Molecular profiling of drug resistant isolates of Mycobacterium tuberculosis in the state of Santa Catarina, southern Brazil..pdf: 292609 bytes, checksum: 4bea0aaa468b44fe8ec1bba4d8017a9e (MD5) Previous issue date: 2015Universidade Federal de Santa Catarina. Laboratório de Biologia Molecular, Sorologia e Micobactérias. Florianópolis, SC, BrasilUniversidade Federal de Santa Catarina. Laboratório de Biologia Molecular, Sorologia e Micobactérias. Florianópolis, SC, BrasilUniversidade Federal de Santa Catarina. Laboratório de Biologia Molecular, Sorologia e Micobactérias. Florianópolis, SC, BrasilUniversidade Federal de Santa Catarina. Laboratório de Biologia Molecular, Sorologia e Micobactérias. Florianópolis, SC, BrasilFundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, BrasilFundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, BrasilLaboratório Central de Saúde Pública de Santa Catarina. Florianópolis, SC, BrasilUniversidade Federal de Santa Catarina. Laboratório de Biologia Molecular, Sorologia e Micobactérias. Florianópolis, SC, BrasilDrug resistance is a global threat and one of the main contributing factors to tuberculosis (TB) outbreaks. The goal of this study was to analyse the molecular profile of multidrug-resistant TB (MDR-TB) in the state of Santa Catarina in southern Brazil. Fifty-three MDR Mycobacterium tuberculosis clinical isolates were analysed by spoligotyping and a partial region of the rpoB gene, which is associated with rifampicin resistance (RMP-R), was sequenced. Some isolates were also distinguished by their mycobacterial interspersed repetitive units (MIRU). S531L was the most prevalent mutation found within rpoB in RMP-R isolates (58.5%), followed by S531W (20.8%). Only two MDR isolates showed no mutations within rpoB. Isolates of the Latin American Mediterranean (LAM) family were the most prevalent (45.3%) found by spoligotyping, followed by Haarlem (9.4%) and T (7.5%) families. SIT106 was found in 26.4% of isolates and all SIT106 isolates typed by MIRU-12 (5 out of 14) belong to MIT251. There was a high correlation between the S531W mutation and the LAM family mainly because all SIT2263 (LAM9) isolates carry this mutation. Among isolates with the S531W mutation in rpoB MIRU demonstrates a cluster formed by four isolates (SIT2263 and MIT163) and very similar profiles were observed between eight of the nine isolates. Better characterisation of TB isolates may lead to new ways in which to control and treat TB in this region of Brazil