Charge virale et intégration du génome d'HPV16 au cours de l'histoire naturelle des lésions du col de l'utérus

BESANCON-BU Médecine pharmacie (250562102) / SudocSudocFranceF

Statut viral et immunité muqueuse (des marqueurs prédictifs de l'histoire naturelle des lésions cervicales associées aux HPV)

Le cancer du col de l'utérus demeure un problème majeur de santé publique, car il est le second cancer féminin au monde. Ce sont des virus, les papillomavirus humains (HPV) - et en particulier ceux appartenant aux génotypes à haut risque - qui sont responsables de l'apparition des lésions précancéreuses et cancéreuses du col utérin. Depuis la fin des années 80, le développement de la biologie moléculaire a permis la détection et l'étude de ce virus, apportant une approche supplémentaire dans la prévention de cette pathologie. La détection de cette infection à l'aide de tests validés cliniquement, est une méthode plus sensible et plus reproductible que la cytologie cervico-utérine dans le cadre du dépistage. Si la présence du virus est nécessaire, elle n'est pas suffisante au développement d'un cancer, et de nombreux facteurs liés à l'environnement, à l'hôte ou au virus vont influencer la persistance d'HPV au sein de la cellule. De ce fait, l'histoire naturelle de l'infection est aujourd'hui encore décrite de façon limitée et les relations entre l'hôte et le pathogène ne sont pas clairement comprises. C'est dans ce contexte que mon travail de thèse s'inscrit. - Nous avons montré la nécessité de la validation des performances d'un test de détection des HPV afin de proposer un outil supplémentaire pour le dépistage des lésions cervicales précancéreuses. Nous avons ensuite étudié des facteurs viraux influençant la persistance de l'infection. Après le développement de technique de quantification de l'HPV16 par PCR en temps réel, nous avons confirmé que le test de routine Hybrid Capture® Il fournissait des résultats pouvant être considéré comme quantitatifs. Par ailleurs, nous avons défini une valeur seuil de charge virale HPV16 de 200 copies pour 1 000 cellules comme étant cliniquement relevante, et nous avons aussi montré que l'évolution de la charge virale entre deux points de suivi pouvait constituer un élément prédictif de l'apparition des lésions précurseurs. Ces résultats nous ont permis de caractériser les infections relevantes des infections non relevantes sans pour autant connaître à quel instant de l'histoire naturelle de la pathologie se trouvaient les patientes. Nous avons montré aussi que le taux d'intégration du génome d'HPV16 dans celui de la cellule hôte constitue un marqueur de malignité de la lésion, car une augmentation de ce taux est observée avec l'augmentation du grade des lésions. De plus, des profils de taux d'intégration en fonction de la charge virale sont caractéristiques des lésions, ce qui semble montrer le lien ente ces deux facteurs, et montrer que de fortes CV pourraient induire une plus forte probabilité d'intégration. Le facteur immunitaire s'avère déterminant dans l'évolution de ces infections, et nous avons montré qu'une accumulation de cellules immunitaires de type CD4+ accompagne la régression des lésions. Inversement, la diminution du ratio CD4+/CD8+ pourrait constituer un marqueur de mauvais pronostic. Ces résultats suggèrent une défaillance probable de la réponse cellulaire dans les cancers. En revanche, l'induction d'une réponse humorale par la vaccination prophylactique anti-HPV est efficace contre le développement des lésions précurseurs, et nous avons montré qu'un vaccin dirigé contre les types 16 et 18 pourrait cibler près de 70% des lésions précurseurs et de plus de 80% des cancers en France. - La mise en évidence et l'étude de ces facteurs restent actuellement les meilleurs moyens de comprendre cette pathologie complexe qu'est le cancer du col de l'utérus, et d'améliorer ainsi la prise en charge des patientes qui échapperont à la vaccination prophylactique.Cervical cancer remains a major problem of public health, because it is the second female cancer. Human papillomavirus (HPV) and in particular from high risk genotypes are responsible for the appearance of the precancerous and cancerous lesions of the uterine cervix. Since the end Eighties, the development of molecular biology allowed the detection and the study of these viruses, providing an additional approach prevention of this patllology. Detection of this infection with clinically valid test is a more sensitive and a more reproducible method than cytology for the screening. If HPV are necessary, they are not sufficient to induce cervical cancer development, and many factors related to the environment, the host or the virus will influence the persistence of HPV infection. So the natural history of the infection is still today described in a limited way and the relations between the host and the pathogenic are not clearly understood, and it is in this context that my PhD is registered . - We showed the necessity to validate performances of an HPV detection test in order to propose an additional tool for the screening of cervical precancerous lesions. Using adapted methodologies, we studied viral factors influencing persistence of the infection. We defined a HPV16 viral load threshold value of 200 copies for 1 000 cells and we showed this value was clinically relevant. Moreover, the viral load evolution between two points of follow-up could constitute a predictive factor for the appearance of precursor lesions. These results enabled us to characterize relevant relevant infections. We also showed that the viral genome integration percentage constitutes a marker of malignity. Indeed, an increase in this rate is linked to the grade of the lesion. Moreover, profiles of integration percentage according to the viral load are characteristics of the lesions, and seem to show the link between these two factors. Thus, be hypothesized that high viral loads could induce a stronger probability of integration. The immune response proves to be determining for the infection evolution, and we showed an accumulation of CD4+ immune cells accompanying lesions potential of regression. Conversely, the decrease of the CD4+/CD8+ ratio could constitute a bad prognostic marker. These results suggest a probable failure of the cellular immune response in cancers. On the other hand, the induction of a humoral response by anti-HPV prophylactic vaccin is efficient against the development of the precursor lesions, and we showed that a vaccine directed against types 16 and 18 could target near 70% of precursors lesions and more than 80% of cancers in France. - The description and the study of these factors remain currently the best means of understanding this complex pathology, and improving the management of the patients who will escape prophylactic vaccination.BESANCON-BU Médecine pharmacie (250562102) / SudocSudocFranceF

Microscopie référencée en position (Motifs pseudo-périodiques mocro-fabriqués pour le positionnement absolu des spécimens avec une précision sub- micrométrique)

Cette thèse propose et démontre une nouvelle approche pour mesurer par vision la position d'une cible dans le plan XY. La mise en œuvre concerne la microscopie optique d'échantillons biologique grâce à des boîtes de culture cellulaire référencées en position. Conçus et réalisés spécifiquement, ces prototypes constituent un référentiel de position solidaire des cultures biologiques. Cela permet le repositionnement très précis des spécimens sous le microscope ainsi que la superposition digitale des images enregistrée au centième de pixel. Cette méthode est validée par le suivi site à site des transformation et déplacements cellulaires au cours du temps, malgré le transfert répété des préparations du microscope à l'incubateur. La méthode repose sur le traitement numérique des images d'un motif pseudopériodique micro-fabriqué en salle blanche et déposé sur la cible à poursuivre. Une mesure binaire -absolue mais pas résolvante_ est combinée avec une mesure linéaire - relative mais très résolvante- pour obtenir un repérage absolu et très précis de la position et de l'orientation de l'objet dans le plan. Le traitement binaire est basé sur un cryptage de la position sous la forme de séquences pseudo-aléatoire de type LFSR étendues à deux dimensions. Le traitement linéaire est basé sur des calcul de phase après filtrage dans le domaine spectral. L'information de phase sert également au calcul du contraste local des séquences binaires, ce qui confère une très grande robustesse au décodage binaire de position. A partir d'un motif de période 4um, les performances obtenues correspondent à 20 nm de résolution en position latérale et 10 -20 en orientation dans le plan.BESANCON-BU Sciences Staps (250562103) / SudocSudocFranceF

Mitochondrial translocation of p53 and mitochondrial membrane potential (ΔΨm) dissipation are early events in staurosporine-induced apoptosis of wild type and mutated p53 epithelial cells

International audienceThe mitochondrial localization of p53 is an important event in p53-dependent apoptosis. Some p53 mutants defective for transcription also facilitate apoptosis through changes of the mitochondria. Here, apoptosis of HeLa and CaSki cells (p53(wt)), C33A and HaCat cells (p53(mt)) and SaOs-2 cells (p53 deficient) was induced by 300 nM staurosporine. We showed that wild-type p53, as well as p53 mutants, were transiently located to the mitochondria with changes in the mitochondrial membrane potential (Delta Psi m). However, in C33A cells harboring a p53 mutated on its DNA binding domain, Delta Psi m collapse and Sub-G1 DNA content were reduced compared to p53(wt) cells, whereas no significant difference was observed in HaCat cells with a p53 mutated on UV hot spots. In addition, inhibition of the mitochondrial permeability transition pores by cyclosporine A significantly reduced the Delta Psi m loss and the sub-G1 DNA content in p53 positive cells. These results indicate that Delta Psi m collapse is an early and necessary event, which plays an important role in apoptosis of immortal mammalian cells

[Human papillomavirus infection]

International audienc

Human papillomavirus in melanoma.

International audienc

New HPV16 viral biomarkers to understand the progression of cervical lesions towards cancer.

International audienc

Detection of cervical precancer and cancer in a hospital population

International audienceThe aim was to determine the relevance of human papillomavirus (HPV) testing in identifying high-grade cervical intraepithelial neoplasia or worse (CIN2/3+) in a hospital population (n=3574) characterised by a high rate of cytological abnormalities and high-risk HPV infections. According to the results of the initial Papanicolaou and HPV test, women were directly referred for colposcopy/biopsy or recalled for a control visit. Sensitivity and specificity were corrected for verification bias. HPV-testing sensitivity was 94.3%, higher than that of cytological testing at any cut-off point (65.1%-86.8%), while specificity was greater for cytology than for HPV testing (99.3% or 91.8% versus 83.4%). The combination of both tests allowed 100% sensitivity and negative predictive value. We conclude that HPV testing is a relevant tool for the detection of cervical disease. The best way of combining cytology and HPV detection in screening programmes should be evaluated in large-scale studies

High-Risk Papillomavirus Infection Is Associated with Altered Antibody Responses in Genital Tract: Non-specific Responses in HPV Infection

International audienceIn order to gain more information about local humoral immune responses to HPV infection, we quantified IgG, IgM, secretory-IgA (S-IgA), and total-IgA by ELISA, and lysozyme and lactoferrin by TR-IFMA, in cervical and cervicovaginal secretions of 40 healthy women and 28 high-risk HPV infected patients (11 were HPV16+). IgG, total-IgA, and S-IgA concentrations in cervicovaginal secretions (p < 0.0001) and high IgG and total-IgA concentrations (p < 0.001 and p < 0.01, respectively) in endocervical secretions were significantly higher in HPV+ patients than in the healthy group. Since the S-IgA/total-IgA ratio was significantly lower in cervicovaginal (7.5%) and endocervical secretions (36.5%) in HPV+ women compared to the control group (p < 0.003 and p < 0.001, respectively), HPV could be responsible for an increase in local production of non-secretory IgA (monomeric and dimeric forms). IgG and total-IgA concentrations in cervicovaginal and endocervical secretions fell in the same general percentage range in both HPV16+ and HPV+ groups (80% and 15%, respectively). However, the S-IgA/total-IgA ratio was much lower in HPV16+ than in HPV+ women, in both cervicovaginal secretions (3.4%) (p < 0.003) and in endocervical secretions (23.3%) (p < 0.001). Innate immunity proteins and local S-IgA response could not stop the spread of HPV infection in spite of high lysozyme and lactoferrin concentrations. HPV16+ disturbed the local humoral immune system, which could partly explain its low clearance