Padronização de um ensaio in vitro para triagem de fármacos anti-trypanosoma utilizando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas

Submitted by Repositório Arca ([email protected]) on 2019-05-09T14:22:30Z No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5)Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio ([email protected]) on 2019-05-09T17:56:28Z (GMT) No. of bitstreams: 3 Diogo Crispim Nascimento Portella. Padronização...2018.pdf: 2890458 bytes, checksum: e459aa15094a6e14ecea4e10c7b0051c (MD5) Diogo Crispim Nascimento Portella. Padronização...2018.pdf: 2890458 bytes, checksum: e459aa15094a6e14ecea4e10c7b0051c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5)Made available in DSpace on 2019-05-09T17:56:28Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Diogo Crispim Nascimento Portella. Padronização...2018.pdf: 2890458 bytes, checksum: e459aa15094a6e14ecea4e10c7b0051c (MD5) Diogo Crispim Nascimento Portella. Padronização...2018.pdf: 2890458 bytes, checksum: e459aa15094a6e14ecea4e10c7b0051c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2018O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001 FINEP; FAPESB.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.A doença de Chagas é causada pela infecção crônica pelo Trypanosoma cruzi e continua sendo um grave problema de saúde na América Latina. As opções terapêuticas para a doença de Chagas são limitadas, com apenas dois medicamentos aprovados para uso. A cardiotoxicidade não prevista nas fases de desenvolvimento de novas drogas é a maior causa de retirada de medicamentos do mercado. A utilização de cardiomiócitos humanos produzidos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC-CM) pode auxiliar no desenvolvimento farmacológico através do estabelecimento de ensaios mais preditivos do que a utilização de linhagens imortalizadas ou células de animais. OBJETIVOS: Neste estudo utilizamos cardiomiócitos humanos produzidos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC-CM), objetivando avaliar simultaneamente a atividade anti-Trypanosoma cruzi e a citotoxicidade de compostos químicos selecionados. MÉTODOS: Foram utilizados nos ensaios hiPSC-CM produzidos a partir da diferenciação celular de linhagens de células-tronco obtidas de três doadores. Três compostos previamente avaliados quanto à atividade anti-T. cruzi - BA5 (derivado do ácido betulínico), GT5A e GT5B (derivados tiazolidínicos) - foram avaliados, utilizando o benzonidazol como controle. As células foram infectadas com T. cruzi (cepa Y) e incubadas por 48 h com diluições seriadas dos compostos para determinação dos valores de EC50 e CC50. Medidas de toxicidade subletal, incluindo avaliação do citoesqueleto por coloração com faloidina, de mitocôndrias utilizando mitotracker e dosagens de BNP, marcador de estresse cardíaco, foram incluídas no ensaio. Análise multiparamétricas automatizadas foram realizadas no sistema Operetta HCS. RESULTADOS: A diferenciação de hiPSC em cardiomiócitos teve eficiência de 83% quanto à expressão de troponina T cardíaca. O benzonidazol apresentou EC50 = 6,1 M e CC50 > 100 M. O BA5 apresentou EC50 = 3,2 M e CC50 = 37 M, o GT5A apresentou EC50 = 1,9 M e CC50 = 87 M, enquanto que o GT5B apresentou EC50 = 0,08 M e CC50 = 27 M. Análises de toxicidade subletal revelaram uma redução da intensidade de fluorescência compatível com a toxicidade mitocondrial, observada pela coloração de mitotracker, para doxorrubicina e BA5 após 1 h de incubação, enquanto a biomassa mitocondrial estava aumentada 48 h após a incubação com os compostos. A redução na marcação de faloidina foi observada com BA5 e doxorrubicina após 48 h de incubação. Níveis aumentados de BNP foram observados com o tratamento com BA5. CONCLUSÃO: A utilização de hiPSC-CM no fluxo de trabalho de desenvolvimento de fármacos para a doença de Chagas pode auxiliar na identificação de novos compostos. O ensaio mostrou-se viável por permitir avaliar rapidamente a ação anti-T. cruzi dos compostos, além de parâmetros de cardiotoxicidade, que podem aumentar o valor preditivo dos testes. Novos estudos serão necessários para que este ensaio seja aprimorado e validado quanto ao seu poder preditivo.Background: Chagas disease is caused by chronic infection with Trypanosoma cruzi and remains a serious health problem in Latin America. Therapeutic options for Chagas disease are limited, with only two drugs approved for use. Unpredicted cardiotoxicity in the development stages of new drugs is the major cause of drug withdrawal on the market. The use of human cardiomyocytes produced from induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) may help in pharmacological development by establishing more predictive assays than the use of immortalized lineages or animal cells. AIM: In this study we used human cardiomyocytes produced from induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM), aiming at simultaneously evaluating the anti-Trypanosoma cruzi activity and the cytotoxicity of selected chemical compounds. Methods: hiPSC-CM assays were performed using cells from three donors. Three compounds previously screened for anti-T. cruzi activity - BA5 (derived from betulinic acid), GT5A and GT5B (thiazolidine derivatives) - were evaluated using benzonidazole as a control. Cells were infected with T. cruzi (Y strain) and incubated for 48 h with serial dilutions of the compounds for determination of EC50 and CC50 values. Sublethal toxicity measurements, including cytoskeletal evaluation by phalloidin staining, of mitochondria using mitotracker and dosages of BNP, cardiac stress marker, were included in the assay. Automated multiparametric analyses were performed on the Operetta HCS system. Results: The differentiation of hiPSC in cardiomyocytes had an efficiency of 83% for cardiac troponin T expression. Benzonidazole showed IC 50 = 6.1 μM and CC50 > 100 μM. BA5 had EC50 = 3.2 μM and CC50 = 37 μM, GT5A had EC50 = 1.9 μM and CC50 = 87 μM, while GT5B had EC50 = 0.08 μM and CC50 = 27 μM. Sublethal toxicity analyzes revealed a reduction in mitochondrial toxicity compatible with mitochondrial toxicity observed by mitotracker staining for doxorubicin and BA5 after 1 h of incubation, while mitochondrial biomass was increased 48 h after incubation with the compounds. The reduction in phalloidin labeling was observed with BA5 and doxorubicin after 48 h of incubation. Increased levels of BNP were observed with treatment with BA5. Conclusion: The utilization of hiPSC-CM in the drug development workflow for Chagas disease may help in the identification of novel compounds. The assay was shown to be .feasible because it allows rapid assessment of the anti-T. cruzi action of the compounds, in addition to cardiotoxicity parameters, which may increase the predictive value of the tests. Further studies will be required for this assay to be improved and validate for its predictive power

Assessment of syndecan-4 expression in the hearts of Trypanosoma cruzi-infected mice and human subjects with chronic Chagas disease cardiomyopathy

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio ([email protected]) on 2019-01-25T17:30:27Z No. of bitstreams: 1 LAROCCA,T.F. Assessment of syndecan-4...2018.pdf: 10166331 bytes, checksum: 0c3c0d4a7677f38a2fd443a1fc5f6d95 (MD5)Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio ([email protected]) on 2019-01-25T17:58:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 LAROCCA,T.F. Assessment of syndecan-4...2018.pdf: 10166331 bytes, checksum: 0c3c0d4a7677f38a2fd443a1fc5f6d95 (MD5)Made available in DSpace on 2019-01-25T17:58:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LAROCCA,T.F. Assessment of syndecan-4...2018.pdf: 10166331 bytes, checksum: 0c3c0d4a7677f38a2fd443a1fc5f6d95 (MD5) Previous issue date: 2018National Council for Research (CNPq), Research Foundation of Bahia State (FAPESB), and Funding Authority for Studies and Projects (FINEP).Hospital São Rafael. Centro de Biotecnologia e Terapia Celular. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.Hospital São Rafael. Centro de Biotecnologia e Terapia Celular. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.Hospital São Rafael. Centro de Biotecnologia e Terapia Celular. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.Hospital São Rafael. Centro de Biotecnologia e Terapia Celular. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.Hospital São Rafael. Centro de Biotecnologia e Terapia Celular. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.Hospital São Rafael. Centro de Biotecnologia e Terapia Celular. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.Hospital São Rafael. Centro de Biotecnologia e Terapia Celular. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Universidade federal da Bahia. Salvador, BA, Brasil.Messejana Hospital. Fortaleza, CE, Brasil.Messejana Hospital. Fortaleza, CE, Brasil.Hospital São Rafael. Centro de Biotecnologia e Terapia Celular. Salvador, BA, Brasil.Hospital São Rafael. Centro de Biotecnologia e Terapia Celular. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.Chronic Chagas cardiomyopathy (CCC) is characterized by the presence of a multifocal inflammatory response and myocardial damage, leading to fibrosis, arrhythmias and ventricular dysfunction. The expression of syndecan-4, a transmembrane proteoglycan, was previously found to be increased in the hearts of mice chronically infected with Trypanosoma cruzi. The possible involvement of syndecan-4 in the disease pathogenesis, however, remains unknown. Here we evaluated the pattern of expression of syndecan-4 in the heart tissue of T. cruzi infected mice and subjects with Chagas cardiomyopathy, correlating with the degree of inflammation and fibrosis