A doménzáródás szerepe az aktív centrum kialakításában: irányított mutagenezis vizsgálatok a 3-foszfogicerát kinázon = Role of domain closure in formation of the active site geometry by site-directed mutagenesis of 3-phosphogycerate kinase

A két doménból felépülő 3-foszfoglicerát kináz (PGK) doménzáródással működő enzim. Nem ismert, hogy mi a doménzáródás alapvető mozgató rugója, hogy miért szükséges mindkét szubsztrát egyidejű kötődése, és ez milyen molekuláris mechanizmussal indítja el a doménzáródást. Biofizikai módszerekkel és az ismert kristályszerkezetek összehasonlításával megállapítottuk, hogy miért stabilizálja bármelyik szubsztrát kötődése a másik domént és miért csak a terner komplexek esetében jön létre a zárt konformáció. A szubsztrátok együttes kötődése működteti a ?L-ben elhelyezkedő kettős molekuláris kapcsolót. A konformációváltozások közvetítésében résztvevő interdomén-régió és a MgATP kötésében résztvevő konzervatív oldalláncokat irányított mutagenezissel Ala-ra cseréltem és kinetikai ill. biofizikai vizsgálatoknak vetettem alá. Megállapításaim: 1) Az R38 mellett a K215 is katalitikus oldallánc, mely a MgATP ?-foszfátjával együtt mozdul el és azt a megfelelő helyzetbe pozícionálja a katalízis és a doménzáródás során. 2) Nukleotid szubsztrát által kiváltott konformációs hatás molekulán belüli terjedésének mechanizmusában a K219 mellett az N336 és a E343 játszik kulcs szerepet. 3) A bL redő konzervatív S392, T393, valamint a környező F165, E192 és F196 oldalláncoknak is fontos szerepe van a 3-PG indította konformációváltozás továbbításában, azonban egyetlen vizsgált oldallánc sem felelős egyedül a molekuláris csukló működtetéséért, hanem ezek együttes kapcsolatrendszere szabályozza azt. | 3-Phosphoglycerate kinase (PGK) is a two-domain hinge-bending enzyme with a well-structured interdomain region. The mechanism of domain?domain interaction, its regulation by substrate binding, the requirement of both substrates for binding and the mechanism of substrate assisted domain closure is not yet fully understood. Molecular graphical analysis of the known crystal structures and biophysical investigations have shown, that binding of either substrate stabilizes the other domain and binding of both substrates is essential for domain closure and also directs the operation of a double molecular switch at the ?L. Site directed mutations were designed at the MgATP binding site and the interdomain region: 10 conserved residues were changed to Ala and were investigated in functional and biophysical measurements. Main findings are: 1) K215 is a catalytic residue, like R38. This interacts with the g-phosphate of MgATP and assists in its proper positioning for the catalysis during domain closure. 2) The nucleotide site residues (K219, N336, E343) have essential role in the transmission of the nucleotide induced effect towards the main hinge. 3) S392 and T393 residues in bL and the surrounding F165, E192 and F196 are involved in transmission of the effects of 3-PG from one domain to the other. Neither of these side-chains is responsible alone for functioning of the molecular hinge at the ?L, rather the cumulative effects of their multiple interactions operate in the hinge region

A moduláris szerveződés szerepe a fehérjék térszerkezetének kialakulásában és a katalítikus funkció megvalósításában = Role of Modular Organization in Formation of the Protein Structure and in Realization of the Enzime Function

A 3-foszfoglicerát kináz két doménje közötti együttműködés mechanizmusát írjuk le, amely a domének záródásához vezet és amely az enzim működéséhez szükséges. Funkcionális (enzimkinetika, ligandkötés, irányított mutagenézis) és szerkezeti (krisztallográfia, molekuláris grafika, modellezés, SAXS, DSC) vizsgálatainkból megállapítottuk, hogy i. a kötött szubsztrátok flexibilis foszfátjai időleges kölcsönhatásuk révén hozzájárulnak bizonyos hélixek elmozdulásához és így elősegítik a doménzáródást; ii. az R38 és K215 oldalláncok szükségesek mind a doménmozgáshoz, mind a katalízishez; iii. a terner enzim-szubsztrát komplexben kialakuló speciális H-kötés láncolat felelős az L-jelű béta-redőben lévő fő csukló régió működéséért. A termofil, mezofil és hidegtűrő izopropilmalátdehidrogenázzal végzett összehasonlító denaturációs-renaturációs vizsgálataink megmutatták, hogy a hőstabilitási különbségek a különböző denaturációs sebességekkel hozhatók összefüggésbe. A renaturációs folyamatok hasonló sebessége viszont a konzervativ oldalláncok között létrejövő specifikus kapcsolatoknak tulajdonítható. | Mechanism of interplay between two domains of 3-phosphoglycerate kinase leading to domain closure over the active site, a general problem associated with enzyme function, has been deduced from functional (enzyme kinetic, ligand binding, mutagenesis) and structural (crystallography, molecular graphics, modelling, SAXS, DSC) studies. The main points are: i. the bound substrates assist in movement of certain helices through the temporal interactions with their flexible phosphates and thereby promotes domain closure; ii. the side chains R38 and K215 are essential both in domain movement and the catalysis; iii. a special H-bond network, formed in the ternary enzyme-substrate complex, is responsible for operation of the main hinge at beta-strand L. ? Comparative unfolding-refolding studies with thermophilic, mesophilic and psychrotropic isopropylmalatedehydrogenases have revealed the importance of their different unfolding rates in their different thermal stabilities. The similar refolding rates, however, can be related to formation of specific interactions of the conserved side chains

Enzimreakciók vizsgálata a moduláris szerveződés, az atomi kölcsönhatás és a kvantummechanika szintjein. A fehérje biofizika tudományos iskolája = Insight into the Enzyme Action at Levels of modular Organization, Atomic Interactions and Quantum-Mechanics. School of Protein Biophysics

Az elmúlt 3 év koherens kutató munkája során születtek speciális tudományos eredmények és levontunk ezekből általános következtetéseket is. Munkánk mérlege a nemzetközi folyóiratokban megjelent 30 közlemény összesen 130 IF-al. Molekuláris immunológiai kutatásaink keretében meghatároztuk 4 komplement proteáz és a C1-inhibitor szerkezetét, különösen az utóbbi hozott számunkra nagy nemzetközi elismerést. A szerkezetek és funkcionális eredményeink alapján általánosan elfogadott aktiválási modellt dolgoztunk ki a komplement rendszer lektin útjának szabályozási mechanizmusára. Jelentősnek tartjuk a C1-inhibitor heparin által történő potencirozásának mechanizmusára javasolt, szerkezeti alapú modell kidolgozását, a flagellin fehérje egyik rendezetlen szakaszának export szignálként történő azonosítását (szabadalom is született belőle), a foszfoglicerátkináz enzim domén záródásban résztvevő allosztérikus jeltovábbító hálózat azonosítását, az enzimaktivitás rendhagyó hőmérsékletfüggésének a konformációs flexibilitás alapján történő értelmezését a izopropilmalát dehidrogenáz esetében, átmeneti zóna felfedezését a rendezett és rendezetlen szerkezetet kódoló aminósav szekvencák között. A komplement fehérjék és funkcionális komplexeik, a flagelláris rendszerek, multidomén enzimek együttes vizsgálata lehetővé tette a fehérjék önszerveződésével, a molekuláris szintű felismeréssel és az allosztérikus jeltovábbítás mechanizmusával kapcsolatos általános következtetések levonását. | We have determined the structure of C1-Inhibitor and four complement proteinases: C1r, MASP1, MASP2 in zymogen form and MASP2 in activated form. Based on our structural and functional studies we concluded a mechanistic model for the activation of the lectin pathway of the complement system. We also devised a structure based model for the heparin potentiation of C1-Inhibitor. An intrinsically disordered sequence of the bacterial flagellin protein was identified as an export signal (patented). Other significant achievements: the mapping of an allosteric network involved in the ligand induced hinge closure of phosphoglycerate kinase, the interpretation of the odd temperature dependence in the catalytic activity of isopropylmalate dehydrogenase in terms of concerted conformational fluctuations, discovery of the twilight zone between amino acid sequences encoding ordered and disordered conformations. Our coherent studies on the functional protein complexes of the complement system, on flagellar systems, multidomain enzymes enabled us to make some general conclusions regarding the self assembly, recognition and allosteric behaviour of proteins and protein complexes

Fehérjék konformációs dinamikája mint a biomolekuláris felismerés és jelátvitel meghatározó eleme = Protein conformational dynamics as a key determinant in biomolecular recognition and signal transmission

A térszerkezet alapján, a konformációs dinamika figyelembevételével kíséreltük meg az intramolekuláris és molekulák közötti jelátvitel megértését atomi felbontással. Kísérleti objektumok: a komplement rendszer, azon belül is a nemrég felfedezett lektin út fehérjekomplexei, a flagelláris exportrendszer valamint moduláris monomer, dimer és oligomer felépítésű enzimek álltak. Megállapítottuk, hogy FliI ATPáz, amely képes az exportálandó fehérjéje kitekerésére, a FliJ, FliH és FliS komponensekkel együtt képez olyan szupramolekuláris komplexet, amely képes az export szubsztrátumok felismerésére. Leírtuk a foszfoglicerát kináz enzim alloszterikus működési mechanizmusát, atomi felbontással. Feltártuk az izopropilmalát dehidrogenáz molekuláris csuklóinak működését és szerepét az alegységek kölcsönhatásaiban. Szelektív inhibitorokkal a tankönyvi tézissel ellentétes felismerésre jutottunk, miszerint a komplement rendszer lektin útjának meghatározó aktivátora a MASP-1 szerin proteáz. Így a komplement aktiválással összefüggő betegségek új gyógyszercélpont molekuláját azonosítottuk. Felfedeztük, hogy a MASP-1 képes a kininogén hasítása útján, bradikinint felszabadítva, komplement függő gyulladást keltésére. Felfedeztük, hogy a trombinhoz hasonlóan a MASP-1, PAR-4 receptoron keresztül endotél sejteket aktivál. Bizonyítékot találtunk arra, hogy a fehérjék konformációs dinamikája meghatározza a szerkezet evolúciójának lehetséges irányait, több milliárd éves időskálán is. | The CUB2 domain of C1r without calcium has disordered structure. This flexibility, necessary for autocativation of C1r inside the C1 complex, is regulated by calcium. Using MASP-selective inhibitors we proved that, in contrast to the previous textbook picture, MASP-1 is the exclusive activator of MASP-2. Blocking the proteolytic activity of MASP-1 prevents activation of the lectin pathway, therefore MASP-1 is a new target in treating complement related diseases. We solved the structure of the catalytic region of MASP-1. The structure explains the special enzymatic characteristics of this complement protease. We discovered a new, inflammation related function of the complement system: MASP-1 is able to directly activate endothelial cells through cleaving protease activated receptor-4. We discovered that MASP-1 is able to cleave kininogen and liberates bradykinin. In this way MASP-1 can contribute to the local inflammatory reaction triggered by complement activation. The allosteric mechanismnof human PGK has been explored at atomic details. In the dimeric enzyme IPMDH structural and site-directed mutagenesis studies revealed the operation of the two main molecular hinges and their relationship with the subunit interactions. We have shown that conformational motions are linked to protein evolution by producing structural variants that can be evolutionarily stabilized. This process is exemplified by segment-swapped proteins, a new group of proteins discovered by us