Inserm : Institut national de la santé e de la recherche médicale [The OA Policy of INSERM, France]

Inserm - the French Institute of Health and Medical Research - is particularly concerned by the free circulation of scientific knowledge. Inserm is strongly involved in the development of an institution repository in which the researchers supported by the institute will deposit their publications and scientific material for the mutual benefit of the scientific community

Apoptotic HPV Positive Cancer Cells Exhibit Transforming Properties

Previous studies have shown that DNA can be transferred from dying engineered cells to neighboring cells through the phagocytosis of apoptotic bodies, which leads to cellular transformation. Here, we provide evidence of an uptake of apoptotic-derived cervical cancer cells by human mesenchymal cells. Interestingly, HeLa (HPV 18+) or Ca Ski (HPV16+) cells, harboring integrated high-risk HPV DNA but not C-33 A cells (HPV-), were able to transform the recipient cells. Human primary fibroblasts engulfed the apoptotic bodies effectively within 30 minutes after co-cultivation. This mechanism is active and involves the actin cytoskeleton. In situ hybridization of transformed fibroblasts revealed the presence of HPV DNA in the nucleus of a subset of phagocytosing cells. These cells expressed the HPV16/18 E6 gene, which contributes to the disruption of the p53/p21 pathway, and the cells exhibited a tumorigenic phenotype, including an increased proliferation rate, polyploidy and anchorage independence growth. Such horizontal transfer of viral oncogenes to surrounding cells that lack receptors for HPV could facilitate the persistence of the virus, the main risk factor for cervical cancer development. This process might contribute to HPV-associated disease progression in vivo

Open and Free Access to biomedical validated scientific knowledge at Inserm

Many in the French scientific arena cannot afford the journals they feel are required. INSERM is therefore examining whether they can circumnavigate the problem for the science they support by pioneering a service that will make all of the results of their funded research available for free. This published and unpublished research will be further linked to other data to offer a web of material that can be better used. Presentation at the Conference "Open Access to Scientific and Technical Information: State of the Art and Future Trends" (Paris, 23-24 January 2003)

Inserm : Institut national de la santé e de la recherche médicale [The OA Policy of INSERM, France]

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ETUDE DE LA REGULATION DE L'EXPRESSION DE LA TOPOISOMERASE IIALPHA PAR L'ICBP90, UNE NOUVELLE PROTEINE HUMAINE

STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Analyse de la fonction de la protéine humaine ICBP90 et l'étude de son rôle dans la régulation de la transcription du gène de la topoisomérase II a humaine (Etudes in vitro et dans les cellules en culture)

Les topoisomérases sont des enzymes ubiquitaires, hautement conservées : elles catalysent l'interconversion des formes topologiques de l'ADN et participent aux processus impliquant la double hélice. L'isoforme a (topoIIa) est essentielle à la survie cellulaire. Dans les cellules normales, la protéine est un marqueur de division cellulaire car son expression est faible pendant les phases G0/G1 et forte pendant la mitose. Cette régulation est altérée dans les cellules cancéreuses dans lesquelles l'enzyme est surexprimée. Ainsi, la topoIIa est une cible primaire des drogues anti-cancéreuses couramment utilisées. Cependant, des modifications de l'expression du gène peuvent être la cause de phénomènes de 'résistance' à ces traitements.ICBP90 (Inverted CCAAT box Binding Protein of 90kDa) est capable d' interagir avec la boîte ICB2 du promoteur du gène de la topoIIa humaine (topoIIah) et serait potentiellement impliquée dans les mécanismes qui contrôlent la régulation de ce promoteur. Pour répondre à cette question, nous avons dans un premier temps étudié le profil d'expression de l'ICBP90 endogène dans du tissu cancéreux. Ces études, combinées à des expériences de synchronisation par privation de sérum de cellules en culture, ont montré que la régulation de l'expression d'ICBP90 était dépendante du cycle cellulaire, induite lors de la transition G1/S et dérégulée dans les cancers. Ce schéma étant en accord avec un rôle de la protéine dans la régulation de l'expression du gène de la topoIIah, nous avons réalisé des transfections transitoires de cellules en culture par de l'ADN recombinant contenant le gène rapporteur CAT, mais aussi des expériences de transcription in vitro. Après avoir caractérisé partiellement le promoteur de la topoIIah, nous avons montré que la surexpression d'ICBP90 était responsable d'une diminution de l'activité de ce dernier et d'une augmentation de celui du HSVtk. Nous avons également utilisé deux techniques différentes pour diminuer la quantité d'ICBP90 endogène: la transfection des cellules HeLa par un siRNA ('small interfering RNA') spécifique, a montré que la diminution de la quantité de cette protéine est accompagnée de celle de topoIIah mais non de celle de la lamine A/C, de la ß-actine et de la grande majorité des protéines nucléaires. Enfin, nous avons réalisé un premier pas vers l'utilisation de l'anticorps monoclonal dirigé contre l'ICBP90 (1RC1C10) à des buts thérapeutiques : ainsi le fragment Fab de cet anticorps a été cloné, exprimé dans E. coli et purifié à partir du surnageant de culture.Topoisomerases are ubiquitous, highly conserved enzymes : they catalyse the interconversion of topological forms of DNA and participate in the procedures which implicate the double helix. The a isoform (topoIIa) is essential to the cell survival. In normal cells, the protein is a marker of cell division since its expression is low during the G0/G1 phase and high during mitosis. This regulation is altered in cancer cells, in which the enzyme is overexpressed. Thus, the topoIIa is a primary target for widely used anticancer drugs. Nevertheless, modifications of the gene expression could lead to 'resistance' phenomena to these treatments.ICBP90 (Inverted CCAAT box Binding Protein of 90kDa) is capable of interact with the ICB2 box of the human topoIIa (htopoIIa) gene promoter and could be involved in the mechanisms controlling the regulation of this promoter. To answer that issue, we studied at first the expression profile of endogenous ICBP90, in cancer tissue. These studies, combined to experiments of cultured cells synchronization by serum starvation, showed that the regulation of ICBP90 was cell-cycle dependent, induced during the G0/G1 phase transition and deregulated in cancer. These findings being consistent with a role of the protein in the regulation of the htopoIIa gene expression, we transiently transfected cultured cells with recombinant DNA containing the reporter gene CAT, but also performed in vitro transcription experiments. After a partial characterization of the htopoIIa gene promoter, we have shown that the ICBP90 overexpression was responsible of a decrease of its activity. On the contrary, an increase of the HSVtk promoter activity was observed. In addition to that, we used two different techniques in order to decrease the endogenous ICBP90 protein quantity: HeLa cells transfection experiments using a specific siRNA ('small interfering RNA'), showed that the decrease in the protein expression was accompanied by a decrease of that of the htopoIIa but not of that of lamin A/C, ß-actin and the majority of nuclear proteins. Finally, we performed a first step towards the use of the monoclonal antibody directed against ICBP90 (IRC1C10) in therapeutic goals : the Fab fragment of this antibody has been cloned, expressed in E. coli and purified from the cultured medium.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Développement de ligands et d outils chimiques pour la protéomique fonctionnelle

L'objectif majeur de ce travail était de développer des sondes site-actif dérivées d'inhibiteurs, comportant des modules chimiques fonctionnels biocompatibles de type photo-liaison, couplage par réaction bio-orthogonale, clivage chimique et module de purification par affinité pour des applications en protéomique. Les applications sont multiples et permettent entre autres de réaliser des études d'identification de complexes moléculaires actifs et de déconvolution de cibles thérapeutiques. Le travail réalisé porte sur la validation de ces modules chimiques au travers de l'étude d'une topoisomérase bactérienne de type II (l'ADN gyrase) et de son inhibiteur antibiotique naturel (la novobiocine) avec la perspective de développer divers types de sondes site actif ciblant d'autres familles d'enzymes. Dans un premier temps une sonde a été développée et une analyse qualitative des chimies de couplage de type cycloaddition de Huisgen et ligation de Staudinger (biocompatibilité, spécificité, efficacité) a été réalisée. Puis cette sonde équipée d'un module clivable azobenzène a ensuite permis de réaliser en condition non dénaturante la purification des complexes impliquant la gyrase B et la déconvolution des cibles de la novobiocine chez Escherichia coli. Enfin, le travail réalisé sur le couple gyrase/novobiocine permis d'initier le développement d'une nouvelle étiquette de purification de complexes basée sur le domaine minimal de fixation de la novobiocine. Le développement d'une sonde ciblant les protéines histones désacétylases a également été entrepris.The major goal of this work was to develop a site specifie probe derived from inhibitors, contammg functional chemical and biocompatible modules (photo-labelling, bio orthogonalligation, chemical cleavage, affinity purification) for proteomic applications. The applications are multiple and would allow identification of protein partners in molecular complexes or target deconvolution studies. The work achieved concems the validation of these chemical modules through the study of a type II bacterial topoisomerase (DNA gyrase) and its antibiotic inhibitor (novobiocin) with the prospect at developing site specific probes targeting other enzyme families. First a probe was developed and a qualitative analysis of the bioorthogonal ligation reaction called Huisgen's cycloaddition was performed to compare to the Staudinger ligation. The biocompatibility, the specificity and the efficiency were analysed. The probe was then equipped with an azobenzene cleavable module and was used to purify (under non-denaturing conditions) multiprotein complexes containing gyrase B and achieve target deconvolution of novobiocin on Escherichia coli. Finally the work done on the gyrase B/novobiocin was used to initiate the development of a new purification tag that can be used for complex enrichment. A probe targeting HDAC proteins has also been developed.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Approche moléculaire des cancers bronchiques

Le cancer bronchique est la première cause de décès par cancer dans le monde. Nous nous sommes intéressés à la caractérisation moléculaire des différents types histologiques de ce cancer ainsi qu'à la détection de l'ADN plasmatique tumoral. Nous avons pu montrer qu'un panel de 7 microsatellites caractérisait 87% d'une population d'adénocarcinomes avec une association préférentielle d'altérations entre les régions 9p21 et 3p24 ou 9q34, et que l'altération de la région 17q23 serait un marqueur de bon pronostic. L'allélotypage de l'ADN plasmatique de 34 patients avec 12 marqueurs a permis de caractériser la présence d'ADN tumoral chez 88% des patients avec une spécificité de 100%. La présence d'altération de l'ADN plasmatique au niveau du chromosome 9 serait de moins bon pronostic. Des panels restreints de microsatellites seraient informatifs d'un type histologique. La détection de l'altération simultanée de l'un ou l'autre allèle dans des prélèvements appariés résultant d'événements indépendants, révèlerait une hétérogénéité clonale des tumeurs bronchiques. Nous avons vérifié que cette hypothèse pourrait être plus générale en étudiant une population de carcinomes colo-rectaux avec un panel de 33 microsatellites. Ces altérations alternatives s'observent sur de nombreux chromosomes, et pourraient identifier de nouvelles régions oncogéniques. Afin de mieux préciser l'origine des sous-types histologiques, nous avons caractérisé des carcinomes épidermoides et des adénocarcinomes par l'étude de loci contenant certains des gènes de la famille des FGFR/FGF et de c-Met/HGF impliqués dans la morphogénèse broncho-pulmonaire. Nous avons identifié des groupes d'altérations différents entre ces deux sous-types, impliquant notamment le locus 15q13-22 contenant FGF7. L'ensemble de ce travail nous a permis d'approfondir les bases moléculaires de la cancérogenèse bronchique et de proposer un test sensible de détection de cellules tumorales bronchiques applicable au suivi des patientsLung cancer is the leading cause of cancer death in the world. We chosen to realize the molecular characterization of different histological types of lung cancer and the detection of tumor plasma DNA. In a first part, we showed by allelotyping that a panel of 7 markers could characterize 87% of adenocarcinomas, revealing that alteration at 17q23 locus should be a good prognosis marker, and showed significant associations between alteration at locus 9p21 and 3p24 or 9q34. Allelotyping of plasma DNA with an enlarged panel of 12 microsatellites in a cohort of 34 lung cancer patients, could characterize 88% of the patients with a specificity of 100%. Shorter panel of markers could be informative for histological type. Furthermore, plasma DNA alteration of chromosome 9 appeared to be correlated with a poorer survival. Simultaneous alteration of one or the other allele in paired samples resulting from independent events, suggested a clonal tumor heterogeneity. We verified this hypothesis in a cohort of colorectal cancer with paired liver metastasis using a panel of 33 markers. Such alternative alterations could be seen at most of the chromosomes, regions of which could contain oncogenes. Furthermore, we have characterized squamous and adenocarcinoma by studying of loci containing some of genes belonging to FGFR/FGF and c-Met/HGF families involved in lung morphogenesis. Different patterns of alterations appeared between these two groups, particularly including 15q13-22 locus containing FGF7. Then, our study underlines new patterns of molecular alterations in lung carcinogenesis by histological sub-type, and allows us to propose a sensitive test for the detection of lung tumor cells, which could be useful for the follow-up of lung cancer patients.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Caractérisation génétique des ostéosarcomes de l'enfant et de l'adolescent

PARIS7-Bibliothèque centrale (751132105) / SudocSudocFranceF