Ring size in cyclic endomorphin-2 analogs modulates receptor binding affinity and selectivity

The study reports the solid-phase synthesis and biological evaluation of a series of new side chain-to-side chain cyclized opioid peptide analogs of the general structure Tyr-[D-Xaa-Phe-Phe-Asp]NH2, where Xaa = Lys (1), Orn (2), Dab (3), or Dap (4) (Dab = 2,4-diaminobutyric acid, Dap = 2,3-diaminopropionic acid), containing 17- to 14-membered rings. The influence of the ring size on binding to the MOP, DOP and KOP opioid receptors was studied. In general, the reduction of the size of the macrocyclic ring increased the selectivity for the MOP receptor. The cyclopeptide incorporating Xaa = Lys displayed subnanomolar MOP affinity but modest selectivity over the KOP receptor, while the analog with the Orn residue showed increased affinity and selectivity for MOP. The analog with Dab was a weak MOP agonist and did not bind to the other two opioid receptors. Finally, the peptide with Xaa = Dap was completely MOP receptor-selective with subnanomolar affinity. Interestingly, the deletion of one Phe residue from 1 led to the 14-membered Tyr-c[D-Lys-Phe-Asp]NH2 (5), a potent and selective MOP receptor ligand. The in vitro potencies of the new analogs were determined in a calcium mobilization assay performed in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells expressing human recombinant opioid receptors and chimeric G proteins. A good correlation between binding and the functional test results was observed. The influence of the ring size, solid support and the N-terminal protecting group on the formation of cyclodimers was studied

Design, Synthesis and Functional Analysis of Cyclic Opioid Peptides with Dmt-Tic Pharmacophore

The opioid receptors are members of the G-protein-coupled receptor (GPCR) family and are known to modulate a variety of biological functions, including pain perception. Despite considerable advances, the mechanisms by which opioid agonists and antagonists interact with their receptors and exert their effect are still not completely understood. In this report, six new hybrids of the Dmt-Tic pharmacophore and cyclic peptides, which were shown before to have a high affinity for the mu-opioid receptor (MOR) were synthesized and characterized pharmacologically in calcium mobilization functional assays. All obtained ligands turned out to be selective antagonists of the delta-opioid receptor (DOR) and did not activate or block the MOR. The three-dimensional structural determinants responsible for the DOR antagonist properties of these analogs were further investigated by docking studies. The results indicate that these compounds attach to the DOR in a slightly different orientation with respect to the Dmt-Tic pharmacophore than Dmt-Tic psi[CH2-NH]Phe-Phe-NH2 (DIPP-NH2[psi]), a prototypical DOR antagonist peptide. Key pharmacophoric contacts between the DOR and the ligands were maintained through an analogous spatial arrangement of pharmacophores, which could provide an explanation for the predicted high-affinity binding and the experimentally observed functional properties of the novel synthetic ligands

Functional selectivity of EM-2 analogs at the mu-opioid receptor

The mu opioid receptor agonists are the most efficacious pain controlling agents but their use is accompanied by severe side effects. More recent developments indicate that some ligands can differentially activate receptor downstream pathways, possibly allowing for dissociation of analgesia mediated through the G protein from the opioid-related side effects mediated by β-arrestin pathway. In an effort to identify such biased ligands, here we present a series of thirteen endomorphin-2 (EM-2) analogs with modifications in positions 1, 2, and/or 3. All obtained analogs behaved as mu receptor selective agonists in calcium mobilization assay carried out on cells expressing opioid receptors and chimeric G proteins. A Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) approach was employed to determine the ability of analogs to promote the interaction of the mu opioid receptor with G protein or β-arrestin 2. Nearly half of the developed analogs showed strong bias towards G protein, in addition four compounds were nearly inactive towards β-arrestin 2 recruitment while blocking the propensity of EM-2 to evoke mu-β-arrestin 2 interaction. The data presented here contribute to our understanding of EM-2 interaction with the mu opioid receptor and of the transductional propagation of the signal. In addition, the generation of potent and selective mu receptor agonists strongly biased towards G protein provides the scientific community with novel tools to investigate the in vivo consequences of biased agonism at this receptor

Pharmacological Characterization of µ-Opioid Receptor Agonists with Biased G Protein or β-Arrestin Signaling, and Computational Study of Conformational Changes during Receptor Activation

In recent years, G protein vs. β-arrestin biased agonism at opioid receptors has been proposed as an opportunity to produce antinociception with reduced adverse effects. However, at present this approach is highly debated, a reason why more information about biased ligands is required. While the practical relevance of bias in the case of µ-opioid receptors (MOP) still needs to be validated, it remains important to understand the basis of this bias of MOP (and other GPCRs). Recently, we reported two cyclopeptides with high affinity for MOP, the G protein biased Dmt-c[d-Lys-Phe-pCF3-Phe-Asp]NH2 (F-81), and the β-arrestin 2 biased Dmt-c[d-Lys-Phe-Asp]NH2 (C-33), as determined by calcium mobilization assay and bioluminescence resonance energy transfer-based assay. The biased character of F-81 and C-33 has been further analyzed in the [35S]GTPγS binding assay in human MOP-expressing cells, and the PathHunter enzyme complementation assay, used to measure β-arrestin 2 recruitment. To investigate the structural features of peptide-MOP complexes, we performed conformational analysis by NMR spectroscopy, molecular docking, and molecular dynamics simulation. These studies predicted that the two ligands form alternative complexes with MOP, engaging specific ligand–receptor contacts. This would induce different displays of the cytosolic side of the seven-helices bundle, in particular by stabilizing different angulations of helix 6, that could favor intracellular coupling to either G protein or β-arrestin

Możliwości technologicznego łączenia różnych surowców białkowych w celu uzyskania preparatów o zakładanych właściwościach funkcjonalnych i żywieniowych

Basing on previous technological experiments a simple process of combining two protein rawmaterials (defatted soybean meal and skim milk) was elaborated in order to obtain protein preparation of favourable and reproducible technological and nutritive characteristics. The effect of processing parameters (ratio of rawmaterials, drying temperature) on properties of obtained preparations was studied for choosing optimal conditions of proposed process.Przebadano 3 rożne warianty technologicznego łączenia odtłuszczonej mąki sojowej z odtłuszczonym krowim mlekiem, spośród których wybrano proces pozwalający na uzyskanie preparatu białkowego przy całkowitej eliminacji operacji chemicznych prowadzących do skrajnych zmian pH mieszaniny. Przebadano wpływ różnych proporcji łączenia ww. surowców, jak i różnych parametrów suszenia walcowego na wartość odżywczą, właściwości fizykochemiczne i funkcjonalne otrzymanych preparatów. Drogą kompleksowej analizy ww. właściwości wytypowano optymalną wersję preparatu otrzymaną przy proporcji łączenia mąki z mlekiem, jak 1:6 (wagowo), suszoną na suszarni walcowej atmosferycznej w temperaturze 120-138°C przez czas 4-6 s. Tak otrzymany preparat charakteryzuje się: a) stosunkowo wysoką wartością biologiczną białka (NPUst.-67,5), b) wysoką neutralnością sensoryczną, c) korzystnymi właściwościami fizykochemicznymi (wysoka absorpcja wody i tłuszczu) i funkcjonalnymi (niskie ubytki dobra konsystencja farszów mięsnych z zastosowaną wymianą mięsa - po obróbce termicznej). Opracowany proces stanowi propozycję bardziej racjonalnego wykorzystania istniejących w kraju nadwyżek mleka, spełniając zarówno technologiczne, jak i żywieniowe wymagania stawiane tego typu preparatom białkowym

Charakterystyka pożądalności zapachu preparatu dymu wędzarniczego

Hedonic response to the odour of smoke flavouring (SF) and its phenolic fractions and relation to the intensity of odour was studied. Experimental results were than compared with theoretical ones, calculated from Tilgner's theorethical formula: good agreement was obtained, what confirms the validity of the formula and its applicability. Additionally, the rules governing summation of hedonic responses for individual fractions when mixed together were considered and discussed.W pracy zbadano pożądalność zapachu dymowego preparatu dymu wędzarniczego i jego trzech frakcji. Metodą skali hedonicznej określono wpływ stężenia PDW i jego frakcji w medium wodnym i tłuszczowym na pożądalność zapachu dymowego. Tą samą metodą przeprowadzono także charakterystykę pożądalności zapachu jako funkcji zmian proporcji dwóch podstawowych frakcji PDW F₁ i F₂ w medium tłuszczowym. W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że najbardziej pożądany zapach posiadała frakcja F₂ (wysokie noty pożądalności w całym badanym przedziale stężeń). Frakcja F₁ posiadała wąski przedział stężeń, w których jej zapach był pożądalny, natomiast frakcja F3 była niepożądana w badanym zakresie stężeń. Badając wpływ proporcji frakcji F₁ i F₂ w ich mieszaninie na pożądalność zapachu przy dwóch poziomach stężeń zauważono, że dla stężenia 750 ppm pożądalność była wysoka dla wszystkich proporcji frakcji w mieszaninie, natomiast dla 1000 ppm wraz ze wzrostem udziału frakcji F₁ następował wyraźny spadek pożądalności. Konfrontacja danych eksperymentalnych i wartości obliczonych z teoretycznych zależności potwierdziła słuszność hipotezy Tilgnera Milera [9] o nakładaniu się pożądalności substancji składanych w ich mieszaninie

Characterisation and morphology of biodegradable chitosan/synthetic polymer blends

Chitosan has been used to form miscible, biodegradable blends with hydrophilic synthetic polymers as PVA and PEO. Characterisation of the blends by DSC, IR and microscopy analysis was made giving much attention to possible interactions of molecular polar group in the polymer chains. PVA/chitosan are found to be amorphous in the whole range of composition having one glass transition temperature. Molecular interactions in the pair of polymers are connected with amide group of chitosan and hydroxyl groups of PVA. PEO/chitosan blends stay amorphous up to 0.2 weight fraction of PEO. For a higher amount of PEO that polymer crystallises forming a spherulite crystalline structure. We correlate the overall kinetics of crystallisation and melting behaviour of solid, semicrystalline blends PEO/chitosan in the form of thin films for a set of PEO species of different blend composition with a morphological structure of the blends. Negative values of the Flory‐Huggins interaction parameter due to specific interactions by hydrogen bonding through ether group of PEO and hydroxyl group of chitosan were evaluated. Amide groups do not participate in the molecular interaction between PEO and chitosan molecules. Avrami equation was applied to describe kinetics of crystallisation of pure PEO and PEO/chitosan blends of various composition

Intensywność i jakość zapachu preparatu dymu wędzarniczego

Detailed sensory characteristics of liquid-smoke extracts (LSE) was made, focussed mainly on the intensity of odour of LSE and its fractions. Experimental results of detection and difference thresholds were then analysed basing on known relations described by Weber-Fechner law. Additionally, preliminary quality characteristics of LSE odour was presented.Scharakteryzowano sensorycznie intensywność i jakość zapachu preparatu dymu wędzarniczego (PDW) i jego trzech frakcji. W ramach oceny intensywności zapachu określono progi wyczuwalności zapachowej i progi różnicy badanych frakcji. Stwierdzono, że frakcja F₁ charakteryzowała się najintensywniejszym zapachem. Jakość zapachu PDW i poszczególnych jego frakcji określono zmodyfikowaną metodą profilową. Przeprowadzono również chromatograficzno-sensoryczną analizę związków zapachowych wchodzących w skład PDW i jego frakcji. Najczystszy zapach wędzonkowy posiadał cały preparat, oraz frakcje F₁ i F₂ w najniższych z ocenianych stężeń (10 i 20 ppm w roztworach wodnych, 250 i 500 ppm w roztworach smakowych). Chromatograficzna-sensoryczna ocena jakości zapachu wykazała różnorodny charakter sensoryczny związków wchodzących w skład PDW i jego frakcji. Wykorzystując dane doświadczalne wykazano, że na podstawie prawa Webera-Fechnera można wyliczyć natężenie wrażenia zapachowego dla dowolnego stężenia PDW lub jego frakcji