Therapeutic implications of physiologic barriers in tumor manifestations

Bei der Therapie maligner Erkraungen stellen anatomisch und funktionell definierte Barrieren eine besondere Herausforderung dar. Tumormanifestationen hinter diesen Barrieren besetzen eine Nische, in der sie einer effektiven Therapie häufig schwer zugänglich sind. Dies trifft insbesondere bei neuroonkologischen Erkrankungen zu, da das zentrale Nervensystem (ZNS) durch die Blut-Hirnschranke (BHS) einer medikamentösen Therapie nur eingeschränkt zugänglich ist. Zur Wertigkeit von etablierten und neuen ZNS-gängigen Therapien konnten bei ZNS-Lymphomen als Modellerkrankung neue Erkenntnisse gewonnen werden. Zum einen wurde die gute Liquorgängigkeit von Ifosfamid (IFO) und seines aktiven Metaboliten bei erwachsenen Patienten belegt und IFO als wirksamer Kombinationspartner einer Hochdosis-Methotrexat (HDMTX) basierten Therapie bei ZNS-Lymphomen untersucht. Für eine HDMTX Monotherapie konnte an einem unselektionierten Patientengut ein günstiger therapeutischer Index insbesondere bei älteren Patienten bestätigt werden, auch bei gleichzeitigem meningealen Lymphombefall. Hinsichtlich der Penetration der BHS durch monoklonale Antikörper konnte eine intensive Anreicherung und klinische Wirksamkeit eines radioaktiv-markierten anti-CD20 Antikörpers (ibritumomab tiuxetan) demonstriert werden. Schließlich wurde durch die begrenzte Wirksamkeit einer intensiven Kombinationstherapie mit den hirngängigen Substanzen IFO und Topotecan bei Hirnmetastasen solider Tumore gezeigt, dass bei diesem Krankheitsbild weniger die BHS als vielmehr die Zytostatikaresistenz des Primärtumors von Bedeutung ist. Eine neue immunologische Therapiemodalität stellen bispezifische Antikörper dar. Diese eignen sich besonders zur intrakavitären Therapie bei Tumorbefall seröser Häute, was am Beispiel einer intrapleuralen Applikation des anti-CD3/anti- EpCAM Antikörpers Catumaxomab dargestellt wurde. Ein verwandter Antikörper, Ertumaxomab, der gegen CD3 und HER2/neu gerichtet ist, wurde im Rahmen einer Phase I Studie beim Mammakarzinom charakterisiert. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass Tumormanifestationen hinter anatomischen und physiologischen Barrieren einer besonderen Betrachtung hinsichtlich der Therapiewahl bedürfen. Insbesondere im Bereich der Neuroonkologie sind aber durch den Einsatz von hirngängigen Substanzen Fortschritte zu verzeichnen.Antatomic and functionally defined barriers in malignant diseases are therapeutically challenging. Access of active treatments is often limited in tumor manifestations secluded behind these barriers. This is particularly true in neurooncology due a limited penetration of substances across the blood- brain barrier (BBB). In central nervous system (CNS) lymphoma as model disease we could gain new insights into the efficacy of established and new agents with the ability to penetrate into the brain. Penetration into cerebrospinal fluid (CSF) of Ifosfamide (IFO) and ist acitve metabolite could be demonstrated in adult patients, and IFO was found to be an effective partner of high-dose methotrexate (HDMTX) in a combination protocol. For HDMTX monotherapy a favourable therapeutic index was confirmed in an unselected cohort, and particularly in elderly patients. Systemic treatment with HDMTX remained effective also in CNS lymphoma with concurrent meningeal dissemination. The penetration of monoclonal antibodies into the brain was demonstrated by application of the radiolabeled anti-CD20 antibody ibritumomab tiuxetan with both intensive uptake in brain lymphomas and clinical activity. Finally, a limited acitvity was found for an intensive chemotherapy combination of IFO and Topotecan in brain metastases of solid tumors, where chemoresistance of the primary tumor rather than the BBB seems to be the main issue. Bispecific antibodies are a new immunologic treatment modality. They seem particularly useful for intracavitary application in serous carcinomatosis as shown with the intrapleural application of the anti-EpCAM /anti-CD3 antibody catumaxomab. A related antibody, ertumaxomab, with specificity for HER2/neu and CD3 was characterized within a phase I study in breast cancer patients. In summary, tumor manifestations behind antaomic and physiologic barriers deserve particular consideration with regard to the choice of effective therapy. Particularly in neurooncology, progress has been achieved by use of substances with the ability to cross the BBB

Establishment of two monoclonal antibodies against proteins of colorectal carcinoma

Titelblatt und Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 7 2. Material und Methoden 22 3. Ergebnisse 59 4. Diskussion 91 5. Zusammenfassung 102 6. Literaturverzeichnis 105Einleitung: Die Qualität immundiagnostischer und -therapeutischer Verfahren zur Behandlung von Tumorerkrankungen hängt entscheidend von Spezifität und Sensitivität der verwendeten Antikörper ab. Ziel war hier die Etablierung neuer monoklonaler Antikörper gegen antigene Proteine aus Membranen von Coloncarcinomzellen. Die Antigene sollten im Gewebe lokalisiert, chromatographisch angereichert und proteinbiochemisch charakterisiert werden. Ergebnisse: Nach Immunisierung von Mäusen mit Membranproteinen aus humanen Coloncarcinomen wurden durch Hybridisierung und Klonierung antikörperproduzierende Zellklone gewonnen. Aufgrund von Affinitätsvergleichen im ELISA mit Präparationen aus Carcinom- und Normalgewebe wurden tumorspezifische Klone selektiert. Die erkannten antigenen Proteine wurden in Coloncarcinom-Membransolubilisaten mittels Western-Blot nachgewiesen. Zwei Antikörper mit besonders hoher Spezifität wurden näher untersucht. MAK 03.1.1 erkannte im Western-Blot eine Proteinbande mit einem relativen Molekulargewicht von 143kD. Das Antigen wurde über mehrere Stufen mittels HPLC angereichert. Tryptische Peptide dieses Proteins wurden mit RP-HPLC getrennt und durch Massen-spektrometrie (MALDI-TOF MS) und N-terminale Sequenzierung analysiert. Die erhaltene N-terminale Sequenz der a1-Kette von Kollagen I erklärt das Bild der im Vorfeld angefertigten Immunhistochemischen Schnitte, die eine starke Anfärbung im Bereich der Lam.prop.mucosae zeigten. Der abgebildete Immunoblot zeigt die Spezifität des Anikörpers für Kollagen I bei gleichzeitig leichter Kreuzreaktivität mit Kollagen III. MAK 05.1.14 zeigte im Western-Blot eine inhomogene Bande zwischen 150 und 200kD. Das Antigen wurde durch Immunaffinitätschromatographie angereichert. Aus der Sequenzanalyse ging hervor, dass es sich um ein Mitglied der CEA-Familie (CD66 etc.) handelt. Dementsprechend zeigen sich auch die immunhistochemischen Färbungen mit MAK 05.1.14, bei denen sich das neoplastisch veränderte Colonepithel ubiquitär stark angefärbt darstellt. Nach Abspaltung der N-Glykane konnte das Antigen noch detektiert werden, nach Abspaltung der Sialinsäuren war das Signal im Immuno-Blot sogar stärker. Diskussion: Mit dem hier beschriebenen Verfahren konnten tumorspezifische monoklonale Antikörper etabliert werden, mit denen nun Korrelationen zwischen Antigenexpression und Lokalisation, Tumorstadium und Prognose untersucht werden können. Die erarbeiteten Verfahren zur Reinigung und Identifizierung der Antigene ermöglichen Untersuchungen zu qualitativen und quantitativen Veränderungen dieser Proteine in Tumoren. Kollagen I und III als Bestandteil des Carcinomstromas spielen eine bedeutende Rolle in der Tumorbiologie. Biochemische Veränderungen der Ketten und Fibrillen sowie pathologische Verteilungsmuster in Gewebeschnitten lassen Schlüsse über Tumororganisation und -malignität zu. Die Etablierung von MAK 05.1.14 belegt die Bedeutung der CEA-Gruppe als Antigene bei maligner Entartung bestimmter Gewebe.Introduction: The quality of immunodiagnostic and ?therapeutic methods greatly depends on the specificity and sensitivity of the antibodies employed. The objective was to develop new monoclonal antibodies against proteins from colorectal carcinoma cell membranes. The respective antigens should be localized in the tissue, chromatographically accumulated and biochemically analysed. Results: After immunization of mice with membrane-proteins from human colorectal carcinoma, antibody producing hybridoma cell clones were established. After affinity assays were performed with ELISA, two cell clones with the most specific detection of carcinoma tissue compared with normal tissue were selected and further characterized. MAK 03.1.1 detected an antigen with a relative molecular weight of 143kD. The antigen was accumulated after multiple chromatographic steps. Tryptic antigenic peptides were fractioned via RP18-HPLC and analyzed with mass-spectrometry and amino-acid sequencing. The resulting sequence corresponded with the alpha-chain of collagen I and explained the staining of interstitial tissue by the antibody in histological tissue slices. Further investigation proved the detection of collagen I with slight cross-reactivity towards collagen III. MAK 05.1.14 showed an inhomogenic pattern between 150 and 200kD in immunoblot detection. The antigen could be isolated by immuno-affinity chromatography. After sequence analysis, it could be identified as a member of the CEA-family. Correspondingly, immunhistochemistry showed intense staining of colorectal carcinoma cells. After deglycosylation the antigen was still detectable in the immunoblot, desialylation even led to stronger signals. Discussion: With the strategy described above, tumorspecific antibodies can be established. Furthermore it is possible to investigate correlations between expression and localisation of the antigen as well as tumor stage and prognosis. Collagen I and III as parts of the extracellular matrix play an important role in tumorbiology. Biochemical alterations of chains and fibrils as well as pathologic distribution patterns allow conclusions about tumor organisation and malignancy. The establishment of MAK 05.1.14 verifies the importance of CEA as an antigen expressed during neoplastic development

Intrasplenic Pancreatic Pseudocyst after Chemoradiation of a Pancreatic Adenocarcinoma Mimicking Progressive Disease: A Case Report and Review of the Literature

Chemoradiation is one of the therapeutic options in palliative treatment of locally advanced pancreatic adenocarcinoma, with a well-known safety profile. In this case report, we describe the treatment-related occurrence of an intrasplenic pancreatic pseudocyst which was successfully removed by gastrocystic drainage. This rare complication should be considered in the follow-up and clinical management of patients, particularly if left-sided complaints occur