Visualisierung von cAMP während der kardialen Differenzierung embryonaler und induzierter pluripotenter Stammzellen

Herzinfarkt ist eine der häufigsten Todesursachen in Deutschland und weltweit. Es entsteht ein irreversibler Schaden des Herzmuskelgewebes durch den Verlust von Kardiomyozyten. Zu einer der vielversprechenden Heilungsmethoden gehört der Einsatz von einem aus Stammzellen künstlich generierten Herzgewebe. Beispielsweise könnte durch Reprogramierungstechnicken patienteneigene Herzmuskelzellen erzeugt und anschließend dem betroffenen Patienten transplantiert werden. Solche Zellen könnten zu einer schnellen Genesung des Patienten führen und nicht vom Körper des Patienten abgestoßen werden. Die Schwierigkeit dieses Verfahrens besteht jedoch unter anderem darin, eine ausreichende Menge an Kardiomyozyten zu einem bestimmten Zeitpunkt für die Behandlung eines Patienten zur Verfügung zu stellen. Daher ist es wichtig die an der kardialen Differenzierung von Stammzellen beteiligten Signalmechanismen zu untersuchen, um durch ihre Modulation die Effizienz und die Schnelligkeit der Differenzierung zu erhöhen. In dieser Arbeit wurde cAMP Signalkaskade als ein möglicher Kandidat für die Verbesserung der kardialen Differenzierung untersucht

Receptor-independent modulation of cAMP-dependent protein kinase and protein phosphatase signaling in cardiac myocytes by oxidizing agents

The contraction and relaxation of the heart is controlled by stimulation of the beta 1-adrenoreceptor (AR) signaling cascade, which leads to activation of cAMP-dependent protein kinase (PKA) and subsequent cardiac protein phosphorylation. Phosphorylation is counteracted by the main cardiac protein phosphatases, PP2A and PP1. Both kinase and phosphatases are sensitive to intramolecular disulfide formation in their catalytic subunits that inhibits their activity. Additionally, intermolecular disulfide formation between PKA type I regulatory subunits (PKA-RI) has been described to enhance PKA's affinity for protein kinase A anchoring proteins, which alters its subcellular distribution. Nitroxyl donors have been shown to affect contractility and relaxation, but the mechanistic basis for this effect is unclear. The present study investigates the impact of several nitroxyl donors and the thiol-oxidizing agent diamide on cardiac myocyte protein phosphorylation and oxidation. Although all tested compounds equally induced intermolecular disulfide formation in PKA-RI, only 1-nitrosocyclohexalycetate (NCA) and diamide induced reproducible protein phosphorylation. Phosphorylation occurred independently of beta(1)-AR activation, but was abolished after pharmacological PKA inhibition and thus potentially attributable to increased PKA activity. NCA treatment of cardiac myocytes induced translocation of PKA and phosphatases to the myofilament compartment as shown by fractionation, immunofluorescence, and proximity ligation assays. Assessment of kinase and phosphatase activity within the myofilament fraction of cardiac myocytes after exposure to NCA revealed activation of PKA and inhibition of phosphatase activity thus explaining the increase in phosphorylation. The data suggest that the NCA-mediated effect on cardiac myocyte protein phosphorylation orchestrates alterations in the kinase/phosphatase balance