Mikroszkópikus gombák (Aspergillus, Fusarium, Cryptococcus) mitokondriális genomszerveződésének összehasonlító elemzése = Study on the mitochondrial genome organisation of some microscopic fungi

Munkánk során meghatároztuk egy Aspergillus niger (1a típus, 31103 bp) és egy A. tübingensis (2b típus, 33656 bp) törzs teljes mitokondriális DNS szekvenciáját. A két genom géntartalma és a gének sorrendje megegyezik, különbséget mindössze a restrikciós enzimek hasítási mintázatában tapasztaltunk. Megállapítottuk, hogy a méretbeli eltérésekért a cox1, atp9 és a ndh4L gének intron-tartalma felelős. Elkészítettük a korábban már RFLP mintázat alapján elkülönített hat A. tübingensis mtDNS fizikai és funkcionális térképét. Eredményeink bizonyították, hogy a tapasztalt intraspecifikus polimorfizmus intron-szerzéssel illetve restrikciós hasítóhelyeket érintő pontmutációkkal magyarázható. Növény-patogén Fusarium törzsek biodiverzitását a mtDNS RFLP mintázata alapján tanulmányoztuk. Több haplotípust sikerült elkülönítenünk a vizsgált 3 fajban. Meghatároztuk e haplotípusok gazdanövény szerinti eloszlását. F. proliferatum lineáris, mitokondriumban lokalizált DNS plazmidjának teljes szekvenálását elvégeztük. A plazmid funkciójára jelenleg nincs bizonyítékunk. Cryptococcus neoformans két varietas-ának mtDNS szerveződését hasonlítottuk össze. Megállapítottuk, hogy a tapasztalt méretbeli különbséget a cox1, cob és LRNS gének eltérő intron-tartalma okozza. Egy másik vizsgált faj, a Trichosporon pullulans 18 kb méretű mtDNS-e a legkisebb, NADH géneket is tartalmazó mtDNS-nek bizonyult élesztőgombák között. | In the present work the complete mitochondrial DNA (mtDNA) of Aspergillus niger mtDNA type 1a (31103 bp) was sequenced and compared to the Aspergillus tubingensis type 2b (33656 bp) mtDNA. The patterns of restriction sites were similar, the gene content and order was identical. The size difference was principally attributed to the intron content of their cox1, atp9 and ndh4L genes. A. tubingensis isolates were earlier classified into six groups on the basis of the mtDNA RFLP pattern. The reason of the intraspecific mtDNA variability was investigated and proved that polymorphism due to intron acquisition and also sporadic point mutations affecting the recognition motifs of the restriction enzymes. Biodiversity of plant-pathogenic Fusarium isolates belonging to 3 different species were studied. On the basis of the RFLP pattern of their mtDNA several haplotypes were identified. The distribution of these haplotypes among host species was determined. The complete nucleotide sequence of a 10 kb linear DNA plasmid was identified, however, its function is still unknown. The functional map of the mtDNAs of two Cryptococcus neoformans varities was constructed. Characteristic sequences were cloned, sequenced and verified that the intron-content of coxI, cob and LRNA genes are responsible for the size differences of the two strains. The study of the organisation of Trichosporon pullulans mtDNA revealed that it is smallest known mtDNA among yeast carrying NADH dehidrogenase genes

Patogén Crytococcusok ellen hatásos killer toxin izolálása, jellemzése és a kódoló gén lokalizálása, klónozása Filobasidium capsulogenumban = Isolation and characterization of killer toxin active against pathogen Cryptococcus, localization and cloning of the toxin coding gene(s) in Filobasidium capsulogenum.

A basidiomycota Filobasidium capsuligenum egy olyan fehérjét szekretál, amely elpusztítja a patogén Cryptococcus neoformanst. Pályázatunkban ezen killer toxin genetikai determinánsát derítettük fel, a toxin fehérje izolálását, jellemzését valósítottuk meg, ill a toxin hatásmechanizmusát is feltártuk. Az érzékenységi tesztek alapján az FC-1 toxin specifikusan, csak a C. neoformans-ra hatott. Bebizonyítottuk, hogy e hatás citocidikus. A toxin protein természetű: hő hatására elbomlik, aktivitásának optimuma pH 4-6. A toxin receptoraként az érzékeny sejtek sejtfalának béta-1,6-glükánját határoztuk meg. E specificitást arra használtuk fel, hogy a toxint affinitáskromatográfiával tisztítsuk. A pusztulán-Sepharose 6B oszlop legaktívabb frakciójával SDS-PAGE-t végeztünk, és 3 protein sávot találtunk a 19 - 51 kDa tartományban. További kísérletek szükségesek a killer aktivitású protein azonosítására. A F. capsuligenum sejtek minilizátainak agaróz gélelektroforézisével kiderítettük, hogy az FC-1 proteint kromoszómális gén kódolja. A toxin hatásmódjának tanulmányozására a celluláris DNS mennyiségének változását a sejtciklus függvényében (DNS szintézis gátlás?) ill. a toxin kezelt sejtek FITC festődését (sejtfal bioszintézis gátlás?) vizsgáltuk. Eredményeink szerint a killing mechanizmus sem a sejtciklustól, sem pedig a sejtfal bioszintézistől nem függ. Sokkal inkább ionofor proteinként hat, amely a citoplazma membránfunkcióját rombolja. | The basidiomycetous yeast Filobasidium capsuligenum produces a killer toxin (FC-1) which is highly effective against the pathogen Cryptococcus neoformans. The goal of this project was to characterize the toxin, determine the genetic trait coding for it, and study its effect on C. neoformans cells. It was demonstrated that FC-1 toxin was specific for C. neoformans. The toxin had a cytocidal effect. FC-1 proved to be a protein: sensitive for heat and proteolytic enzymes. The optimal pH for the activity was within the range of pH 4-6. As receptor site for the killer protein beta-1,6-glucan in the cell wall of sensitive cells was determined. The specificity was used for purification of the toxin through affinity chromatography. The most active fraction from a pustulan-Sepharose 6B column was subjected to SDS-PAGE, and three protein bands, in molecular mass of 19 - 51 kDa, were detected. Additional investigations are necessary to identify the protein with killer property. Agarose gel electrophoresis of F. capsuligenum cell minilysate revealed that FC-1 protein is coded by the chromosomal DNA. Analysis of cellular DNA (inhibition of DNA synthesis?) by laser scanning cytometry and FITC staining (inhibition of cell wall biosynthesis?) of the toxin-treated cells revealed that the killing mechanism of FC-1 is neither cell cycle- nor cell wall biosynthesis-dependent; rather it might act as an ionophoric protein that disrupts the cytoplasmic membrane function