Model DNA for investigation of mechanism of nucleotide excision repair

The living cell DNA is under permanent attack of a variety of exogenous and endogenous damaging factors. Nucleotide excision repair (NER) is main pathway which removes a wide variety of bulky DNA adducts formed by UV light, electrophilic environmental mutagens, and chemotherapeutic agents. NER process in mammalian cells consistently leads to the very specific excision of damaged DNA fragments 24–32 nucleotides in length. The following DNA repair synthesis and DNA ligation restore intact DNA helix. The main set of the genes inactivated in NER-deficient higher eukaryotic cells was identified; about 30 proteins are involved in the specific multi-subunit complexes responsible for NER process. The specific NER feature is wide substrate specificity and great difference of damages elimination efficiencies. A key limiting step in NER is damage recognition and verification. One of the advanced and upcoming approaches to NER process investigation is based on the application of model DNAs – artificial DNA structures, which are analogs of substrate or intermediates of the repair process. This article reviews our current knowledge concerning the model DNA design, synthesis and application as a tool for the NER process comprehensive study.ДНК живих клітин перебуває під постійним впливом різноманітних пошкоджуючих факторів екзо- і ендогенного походження. Нуклеотидна ексцизійна репарація (NER) видаляє з ДНК широкий набір об’ємних адуктів, які утворилися в результаті дії УФ опромінення, а також електрофільних речовин – забруднювачів довкілля, що чинять мутагенний вплив, та хіміопрепаратів. У процесі репарації, яку виконує система NER ссавців, відбувається специфічне вищеплювання з ДНК фрагментів розміром 24––32 нуклеотиди, що містять пошкодження. Подальший репаративний синтез і лігування ДНК відновлюють інтактність спіралі ДНК. Ідентифіковано гени, інактивовані в NER-дефіцитних клітинах вищих евкаріотів. В репарації беруть участь приблизно 30 білків, які формують специфічні мультисубодиничні комплекси. Система NER характеризується широкою субстратною специфичністю і при цьому великими розбіжностями в ефективності видалення пошкоджень. Ключовою лімітуючою стадією процесу є упізнавання та верифікація пошкоджен. До ефективних і таких, що розвиваються, підходів до вивчення процесу NER належить метод, заснований на використанні модельних ДНК – синтетичних структур, які є аналогами субстрата або інтермедіатів цього процесу. Розглянуто існуючі дані щодо способів конструювання модельних ДНК та застосування їх як інструмента для всебічного дослідження процесу NER.ДНК живых клеток находится под постоянным воздействием различных повреждающих факторов экзо- и эндогенного происхождения. Нуклеотидная эксцизионная репарация (NER) удаляет из ДНК широкий набор объемных аддуктов, образовавшихся в результате воздействия УФ облучения, а также электрофильных веществ – загрязнителей окружающей среды, оказывающих мутагенное действие, и химиопрепаратов. В процессе репарации, проводимой системой NER млекопитающих, происходит специфическое выщепление из ДНК фрагментов размером 24–32 нуклеотида, содержащих повреждения. Последующий репаративный синтез и лигирование ДНК восстанавливают интактность спирали ДНК. Идентифицированы гены, инактивированные в NER- дефицитных клетках высших эукариотов. В репарации участвуют примерно 30 белков, формирующих специфические многосубъединичные комплексы. Система NER характеризуется широкой субстратной специфичностью и при этом большими различиями в эффективности удаления повреждений. Ключевой лимитирующей стадией процесса является узнавание и верификация повреждения. К эффективным и развивающимся подходам к исследованию процесса NER принадлежит метод, основанный на использовании модельных ДНК –синтетических структур, являющихся аналогами субстрата или интермедиатов этого процесса. Рассмотрены существующие данные о способах конструирования модельных ДНК и применении их в качестве инструмента для всестороннего изучения процесса NER

Unrepairable substrates of nucleotide excision repair and their application to suppress the activity of this repair system

In the previous studies, the DNA with the bulky Fap-dC derivative was demonstrated to be a difficult substrate for the nucleotide excision repair (NER), a system which is involved in the removal of bulky lesions from DNA. This type of compounds could be of particular interest as possible selective NER, considerably reducing the potency of DNA repair due to competitive immobilization of protein factors involved in this process. This approach can be potentially useful to increase the efficiency of chemotherapy. Aim. To identify DNA structures containing multiple bulky adducts that can efficiently inhibit the nucleotide excision repair. Methods. Enzymatic DNA synthesis, PCR, NER-competent cell extract preparation, in vitro NER assay, HPLC. Results. The conditions for the synthesis of extended DNA containing multiple unrepairable lesions were established. A wide range of DNA structures containing modified nucleotides was obtained. All modified DNAs were shown to inhibit the in vitro activity of the NER system. The DNA structure that inhibits the NER activity with the highest efficiency was selected. Conclusions. The model DNA structures effectively inhibiting the activity of NER were found. The new data obtained here can potentially be used for both basic and applied research.У наших попередніх дослідженнях було показано, що ДНК з об'ємним похідним Fap-dC є складнорепарованим субстратом для системи ексцизійної репарації нуклеотидів (Ерн). З'єднання такого типу можуть становити особливий інтерес як можливі селективні інгібітори системи Ерн, значно знижуючи ефективність репарації ДНК шляхом зв'язування білкових чинників, залучених до даного процесу. Цей підхід може бути потенційно корисний для підвищення ефективності хіміотерапії. Мета. Дане дослідження спрямоване на пошук ДНК-структур, що містять множинні об'ємні аддукти, які з найбільшою ефективністю можуть пригнічувати активність системи. Методи. Ферментативний синтез ДНК, ПЛР, приготування Ерн-компетентних клітинних екстрактів, реакція вирізання, що каталізується білками Ерн in vitro, ВЕРХ. Результати. Проведено підбір умов синтезу протяжних модельних ДНК з множинним включенням нерепарованого пошкодження Fap-dC. Отримано ряд ДНК-структур, що містить в своєму складі різну кількість модифікованих ланок. Показано, що всі отримані ДНК пригнічують активність системи Ерн in vitro. Обрана ДНК-структура, яка пригнічує NER найбільш високою ефективністю. Висновки. Модельні ДНК з нерепарованими ушкодженнями, здатні високою ефективністю пригнічувати NER, можуть розглядатися в якості інгібіторів системи Ерн. Виявлені в даній роботі закономірності потенційно можуть бути використані для проведення як фундаментальних, так і прикладних досліджень.В наших предыдущих исследованиях было показано, что ДНК с объемным производным Fap-dC является труднорепарируемым субстратом для системы эксцизионной репарации нуклеотидов (ЭРН). Соединения такого типа могут представлять особый интерес как возможные селективные ингибиторы системы ЭРН, значительно снижая эффективность репарации ДНК путем связывания белковых факторов, вовлеченных в этот процесс. Этот подход может быть потенциально полезен для повышения эффективности химиотерапии. Цель.Текущее исследование направлено на поиск ДНК-структур, содержащих множественные объемные аддукты, которые с наибольшей эффективностью могут подавлять активность системы. Методы. Ферментативный синтез ДНК, ПЦР, приготовление ЭРН-компетентных клеточных экстрактов, реакция вырезания, катализируемая белками ЭРН in vitro, ВЭЖХ. Результаты. Проведен подбор условий синтеза протяженных модельных ДНК с множественным включением нерепарируемого повреждения Fap-dC. Получен ряд ДНК-структур, содержащий в своем составе различное количество модифицированных звеньев. Показано, что все полученные ДНК подавляют активность системы ЭРН in vitro. Выбрана ДНК-структура, которая ингибирует NER наиболее высокой эффективностью. Выводы. Модельные ДНК с нерепарируемыми повреждениями, способные высокой эффективностью подавлять NER, могут рассматриваться в качестве ингибиторов системы ЭРН. Обнаруженные в настоящей работе закономерности потенциально могут быть использованы для проведения не только фундаментальных, но и прикладных исследований

Synthesis of model DNA and their application as substrates of nucleotide excision repair

Aim. Nucleotide excision repair (NER) is DNA repair system responsible to remove bulky lesions from DNA. These lesions appear in DNA as consequence of UV-light irradiation or environmental stress. Study of NER is extremely important to improve action of chemotherapeutic drugs. Methods. In vitro NER-assay and photoaffinity modification were used. Results. Long linear DNA analogs mimicking NER substrates have been synthesized. DNA analogs are 137-mer duplexes containing in their internal positions nucleotides with bulky substitutes imitating lesions with fluorochloroazidopyridyl and fluorescein groups introduced using spacer fragments at the 4N and 5C positions of dCMP and dUMP (Fap-dC- and Flu-dU-DNA) and DNA containing a (+)-cis-stereoisomer of benzo[a]pyrene-N2-deoxyguanosine (BP-dG-DNA). The interaction of the modified DNA duplexes with the proteins of NER-competent HeLa extract was investigated. The substrate properties of the model DNA in the reaction ofspecific excision were shown to vary in the row Fap-dC-DNA << Flu-dU-DNA < BP-dG-DNA. Conclusions. In vitro assay show that DNA analogs represent an interesting tool for the estimation of cellular repair activities. The developed approach should be of general use forthe incorporation of NER-sensitive distortions into model DNA and seems to be very promising for repair mechanism studies. Keywords: nucleotide excision repair, model bulky substituted DNA substrates.Мета. Ексцизійна репарація нуклеотидів (NER) – це система репарації ДНК, відповідальна за видалення об’ємних пошкоджень зі складу ДНК. Такі пошкодження можуть виникати за впливу як опромінення ультрафіолетом, так і факторів довкілля. Вивчення системи NER є вкрай важливим для підвищення ефективності хіміотерапевтичних препаратів. Методи. Використано реакцію NER in vitro та фотоафінну модификацію. Результати. Синтезовано довгі лінійні ДНК, які імітують субстрати NER, що являють собою 137-мірні ДНК-дуплекси і містять у внутрішніх положеннях ланцюгів нуклеотиди із введеними за допомогою спейсерних фрагментів по 4N- і 5C-положеннях dC і dU фторхлоразидопіридильною і флуоресцеїновою групами (Fap-dC- і Flu-dU- ДНК), а такожДНК, яка вміщує (+)-цис-стереоізомер бензо[a]пі рен-N2- дезоксигуанозину. Досліджено взаємодію модифікованих ДНК-дуплексів з білками NER-компетентного екстракту клітин HeLa. Показано, що субстратні властивості модельних ДНК у реакції специфічної ексцизії змінюються в ряду Fap-dC-ДНК << Flu-dU-ДНК < BP-dG-ДНК. Висновки. Дослідженнями in vitro встановлено, що ДНК-аналоги є важливим інструментом для оцінки клітинної репарації. Розроблений підхід виявився універсальним для включення до складу ДНК пошкоджень, які упізнаються системою NER, а також досить перспективним для вивчення механізмів репарації. Ключові слова: ексцизійна репарація нуклеотидів, модельні ДНК-субстрати.Цель. Эксцизионная репарация нуклеотидов (NER) – это система репарации ДНК, отвечающая за удаление объемных повреждений из состава ДНК. Такие повреждения могут появляться под воздействием как облучения ультрафиолетом, так и факторов окружающей среды. Изучение системы NER крайне важно для повышения эффективности химиотерапевтических препаратов. Методы. Использованы реакция NER in vitro и фотоаффинная модификаця. Результаты. Синтезированы протяженные линейные ДНК, имитирующие субстраты NER, которые представляют собой 137-мерные ДНК-дуплексы, содержащие во внутренних положениях цепей нуклеотиды с введенными с помощью спейсерных фрагментов по 4N- и 5C-положениям dC и dU фторхлоразидопиридильной и флуоресцеиновой группировками (Fap-dC- и Flu-dU- ДНК), а также ДНК, включающая (+)-цис-стереоизомер бензо[a]пирен-N2-дезоксигуанозина. Исследовано взаимодействие модифицированных ДНК-дуплексов с белками NER-компетентно го экстракта клеток HeLa. Показано, что субстратные свойства модельных ДНК в реакции специфической эксцизии меняются в ряду Fap-dC-ДНК << Flu-dU-ДНК < BP-dG-ДНК. Выводы. Исследованиями in vitro установлено, что ДНК- аналоги являются важным инструментом для оценки клеточной репарации. Разработанный подход оказался универсальным для включения в состав ДНК повреждений, узнаваемых системой NER, а также достаточно перспективным для изучения механизмов репарации. Ключевые слова: эксцизионная репарация нуклеотидов, модельные ДНК-субстраты

Synthesis of model DNA and their application as substrates of nucleotide excision repair

Aim. Nucleotide excision repair (NER) is DNA repair system responsible to remove bulky lesions from DNA. These lesions appear in DNA as consequence of UV-light irradiation or environmental stress. Study of NER is extremely important to improve action of chemotherapeutic drugs. Methods. In vitro NER-assay and photoaffinity modification were used. Results. Long linear DNA analogs mimicking NER substrates have been synthesized. DNA analogs are 137-mer duplexes containing in their internal positions nucleotides with bulky substitutes imitating lesions with fluorochloroazidopyridyl and fluorescein groups introduced using spacer fragments at the 4N and 5C positions of dCMP and dUMP (Fap-dC- and Flu-dU-DNA) and DNA containing a (+)-cis-stereoisomer of benzo[a]pyrene-N2-deoxyguanosine (BP-dG-DNA). The interaction of the modified DNA duplexes with the proteins of NER-competent HeLa extract was investigated. The substrate properties of the model DNA in the reaction ofspecific excision were shown to vary in the row Fap-dC-DNA << Flu-dU-DNA < BP-dG-DNA. Conclusions. In vitro assay show that DNA analogs represent an interesting tool for the estimation of cellular repair activities. The developed approach should be of general use forthe incorporation of NER-sensitive distortions into model DNA and seems to be very promising for repair mechanism studies. Keywords: nucleotide excision repair, model bulky substituted DNA substrates.Мета. Ексцизійна репарація нуклеотидів (NER) – це система репарації ДНК, відповідальна за видалення об’ємних пошкоджень зі складу ДНК. Такі пошкодження можуть виникати за впливу як опромінення ультрафіолетом, так і факторів довкілля. Вивчення системи NER є вкрай важливим для підвищення ефективності хіміотерапевтичних препаратів. Методи. Використано реакцію NER in vitro та фотоафінну модификацію. Результати. Синтезовано довгі лінійні ДНК, які імітують субстрати NER, що являють собою 137-мірні ДНК-дуплекси і містять у внутрішніх положеннях ланцюгів нуклеотиди із введеними за допомогою спейсерних фрагментів по 4N- і 5C-положеннях dC і dU фторхлоразидопіридильною і флуоресцеїновою групами (Fap-dC- і Flu-dU- ДНК), а такожДНК, яка вміщує (+)-цис-стереоізомер бензо[a]пі рен-N2- дезоксигуанозину. Досліджено взаємодію модифікованих ДНК-дуплексів з білками NER-компетентного екстракту клітин HeLa. Показано, що субстратні властивості модельних ДНК у реакції специфічної ексцизії змінюються в ряду Fap-dC-ДНК << Flu-dU-ДНК < BP-dG-ДНК. Висновки. Дослідженнями in vitro встановлено, що ДНК-аналоги є важливим інструментом для оцінки клітинної репарації. Розроблений підхід виявився універсальним для включення до складу ДНК пошкоджень, які упізнаються системою NER, а також досить перспективним для вивчення механізмів репарації. Ключові слова: ексцизійна репарація нуклеотидів, модельні ДНК-субстрати.Цель. Эксцизионная репарация нуклеотидов (NER) – это система репарации ДНК, отвечающая за удаление объемных повреждений из состава ДНК. Такие повреждения могут появляться под воздействием как облучения ультрафиолетом, так и факторов окружающей среды. Изучение системы NER крайне важно для повышения эффективности химиотерапевтических препаратов. Методы. Использованы реакция NER in vitro и фотоаффинная модификаця. Результаты. Синтезированы протяженные линейные ДНК, имитирующие субстраты NER, которые представляют собой 137-мерные ДНК-дуплексы, содержащие во внутренних положениях цепей нуклеотиды с введенными с помощью спейсерных фрагментов по 4N- и 5C-положениям dC и dU фторхлоразидопиридильной и флуоресцеиновой группировками (Fap-dC- и Flu-dU- ДНК), а также ДНК, включающая (+)-цис-стереоизомер бензо[a]пирен-N2-дезоксигуанозина. Исследовано взаимодействие модифицированных ДНК-дуплексов с белками NER-компетентно го экстракта клеток HeLa. Показано, что субстратные свойства модельных ДНК в реакции специфической эксцизии меняются в ряду Fap-dC-ДНК << Flu-dU-ДНК < BP-dG-ДНК. Выводы. Исследованиями in vitro установлено, что ДНК- аналоги являются важным инструментом для оценки клеточной репарации. Разработанный подход оказался универсальным для включения в состав ДНК повреждений, узнаваемых системой NER, а также достаточно перспективным для изучения механизмов репарации. Ключевые слова: эксцизионная репарация нуклеотидов, модельные ДНК-субстраты