Preparation of recombinant human ameloblastin

Práce se zabývá srovnáním exprese proteinů v bakteriálních expresních systémech oproti expresi v kvasinkových expresních systémech. Velká část práce je věnována představení nejvýznamnějších kvasinkových druhů využívaných jako expresní systémy a také vektorům, které se v těchto druzích pro expresi používají. Cíle práce jsou zaměřeny na produkci ameloblastinu divokého typu v expresním systému E. coli a jeho následná purifikace. Dále na vytvoření vektoru pro kvasinkový expresní systém, který by obsahoval gen pro ameloblastin divokého typu a jeho další dva mutanty, a to konkrétně ameloblastin delta 5, který postrádá úsek kódovaný exonem 5 a ameloblastin c-terminální část, který kóduje daný protein od 197 do 421 aminokyseliny.The thesis deals with the comparation of protein expression in bacterial expression systems agains expression in yeast expression systems. A big part of the thesis is devoted to introduction of the most important yeast species, which are used as expression systems and also to vectors which are used in these expression systems. The aims of thesis are focused on the production of ameloblastin wild type in E. coli as expression system and subsequent purification. Futher, to create a vector for yeast expression system, which contains the gene for ameloblastin wild type a others two mutatnts, namely ameloblastin delta 5, which lacks segment encoded by the exon 5 and ameloblastin c-terminal part, which encode the protein form the aminoacid 197 to 421.Fakulta chemicko-technologická1) Prezentace výsledků diplomové práce. 2) Diskuze k posudku vedoucího a oponenta diplomové práce. 3) Student zodpověděl všechny dotazy a připomínky k DP

Marfan syndrome

Práce je zaměřena na autosomálně dominantní onemocnění nazvané Marfanův syndrom. V této práci se budu věnovat projevům jak fyzickým, tak i ve struktuře molekuly DNA, které Marfanův syndrom způsobuje. Dále různým variantám tohoto onemocnění, principům stanovení diagnózy, výskytu v ČR a také, které slavné osobnosti našich dějin byly touto chorobou postiženy.Work is focused on autosomal dominant disease called Marfan syndrome. In this work I will discuss of phisical and structural manifest in DNA that causes Marfan syndrome. Also is focused on the different variations of this disease, the principles of diagnosis, the incidence in ČR and also which famous personalities in our history have been affected by this disease.Katedra biologických a biochemických věd1. Prezentace výsledků bakalářské práce. 2. Diskuze k posudku vedoucího bakalářské práce. 3. Student zodpověděl vaechny dotazy a připomínky k BP

Kvantitativní spektrofluorometrická detekce nukleární kondenzace a fragmentace v intaktních buňkách

At present, nuclear condensation and fragmentation have been estimated also using Hoechst probes in fluorescence microscopy and flow cytometry. However, none of the methods used the Hoechst probes for quantitative spectrofluorometric assessment. Therefore, the aim of the present study was to develop a spectrofluorometric assay for detection of nuclear condensation and fragmentation in the intact cells. We used human hepatoma HepG2 and renal HK-2 cells cultured in 96-well plates treated with potent apoptotic inducers (i.e. cisplatin, staurosporine, camptothecin) for 6-48 h. Afterwards, the cells were incubated with Hoechst 33258 (2 mu g/mL) and the increase of fluorescence after binding of the dye to DNA was measured. The developed spectrofluorometric assay was capable to detect nuclear changes caused by all tested apoptotic inducers. Then, we compared the outcomes of the spectrofluorometric assay with other methods detecting cell impairment and apoptosis (i.e. WST-1 and glutathione tests, TUNEL, DNA ladder, caspase activity, PARP-1 and JNKs expressions). We found that our developed spectrofluorometric assay provided results of the same sensitivity as the TUNEL assay but with the advantages of being fast processing, low-cost and a high throughput. Because nuclear condensation and fragmentation can be typical markers of cell death, especially in apoptosis, we suppose that the spectrofluorometric assay could become a routinely used method for characterizing cell death processes.V současné době se k detekci jaderné kondenzace a fragmentace využívají fluorescenční sondy Hoechst. Žádná z metod však nepoužívá sondy Hoechst pro kvantitativní spektrofluorometrické hodnocení. Cílem této studie bylo vyvinout spektrofluorometrický test pro detekci jaderné kondenzace a fragmentace v intaktních buňkách. Použili jsme buňky lidského hepatomu HepG2 a renální HK-2 buňky kultivované v 96-jamkových inkubovanými s apoptotickými induktory (tj. cisplatinou, staurosporinem, kamptotecinem) po dobu 6-48 hodin. Poté byly buňky inkubovány s Hoechst 33258 (2 ug/ml) a bylo detekováno zvýšení intenzity fluorescence po navázání barviva na DNA. Vyvinutý spektrofluorometrický test byl schopen detekovat jaderné změny způsobené všemi testovanými apoptotickými induktory. Poté jsme výsledky spektrofluorometrického testu porovnali s dalšími metodami detekujícími poškození buněk a apoptózu (tj. testy WST-1 a glutathionu, TUNEL, DNA ladder, aktivita kaspázy, exprese PARP-1 a JNKs). Zjistili jsme, že náš vyvinutý spektrofluorometrický test poskytuje výsledky se stejnou citlivostí jako test TUNEL, ale s výhodami rychlého zpracování, nízkých nákladů a vysokého výkonu. Protože jaderná kondenzace a fragmentace mohou být typickými markery buněčné smrti, zejména při apoptóze, předpokládáme, že spektrofluorometrický test by se mohl stát rutinně používanou metodou pro charakterizaci procesů buněčné smrti

Quantitative spectrofluorometric assay detecting nuclear condensation and fragmentation in intact cells

Abstract At present, nuclear condensation and fragmentation have been estimated also using Hoechst probes in fluorescence microscopy and flow cytometry. However, none of the methods used the Hoechst probes for quantitative spectrofluorometric assessment. Therefore, the aim of the present study was to develop a spectrofluorometric assay for detection of nuclear condensation and fragmentation in the intact cells. We used human hepatoma HepG2 and renal HK-2 cells cultured in 96-well plates treated with potent apoptotic inducers (i.e. cisplatin, staurosporine, camptothecin) for 6–48 h. Afterwards, the cells were incubated with Hoechst 33258 (2 µg/mL) and the increase of fluorescence after binding of the dye to DNA was measured. The developed spectrofluorometric assay was capable to detect nuclear changes caused by all tested apoptotic inducers. Then, we compared the outcomes of the spectrofluorometric assay with other methods detecting cell impairment and apoptosis (i.e. WST-1 and glutathione tests, TUNEL, DNA ladder, caspase activity, PARP-1 and JNKs expressions). We found that our developed spectrofluorometric assay provided results of the same sensitivity as the TUNEL assay but with the advantages of being fast processing, low-cost and a high throughput. Because nuclear condensation and fragmentation can be typical markers of cell death, especially in apoptosis, we suppose that the spectrofluorometric assay could become a routinely used method for characterizing cell death processes

Přechodné zvýšení dehydrogenázové aktivity buněk ovlivněných kadmiem předchází zvýšené produkci reaktivních forem kyslíku u lidských proximálních tubulárních buněk ledvin

Cadmium is a heavy metal causing toxicity especially in kidney cells. The toxicity is linked also with enhanced oxidative stress leading to cell death. On the other hand, our recent experiments have shown that an increase of total intracellular dehydrogenases activity can also occur in kidney cells before declining until cell death. The aim of the present study, therefore, was to evaluate this transient enhancement in cell viability after cadmium treatment. The human kidney HK-2 cell line was treated with CdCl2 at concentrations 0-200 μM for 2-24 h and intracellular dehydrogenase activity was tested. In addition, we measured reactive oxygen species (ROS) production, glutathione levels, mitochondrial membrane potential, and C-Jun-N-terminal kinase (JNK) activation. We found that significantly increased dehydrogenase activity could occur in cells treated with 25, 100, and 200 μM CdCl2. Moreover, the results showed an increase in ROS production linked with JNK activation following the enhancement of dehydrogenase activity. Other tests detected no relationship with the increased in intracellular dehydrogenase activity. Hence, the transient increase in dehydrogenase activity in HK-2 cells preceded the enhancement of ROS production and our finding provides new evidence in cadmium kidney toxicity.Kadmium je těžký kov, jehož toxicita se projevuje zejména v ledvinných buňkách. Toxicita kadmia je spojena se zvýšeným oxidačním stresem, který může vést až k buněčné smrti. Naše nedávné experimenty ukázaly, že před vlastní buněčnou smrtí dochází u proximálních ledvinných buněk ke zvýšení celkové aktivity intracelulárních dehydrogenáz. Cílem této studie proto bylo zhodnotit toto přechodné zvýšení viability buněk ovlivněných kadmiem. Buněčná linie lidských ledvinných proximálních tubulárních buněk HK-2 byla ošetřena CdCl2 v koncentracích 0-200 μM po dobu 2-24 hodin a následně byla testována intracelulární dehydrogenázová aktivita. Kromě toho jsme měřili produkci reaktivních kyslíkatých forem (ROS), intracelulární hladinu glutathionu, mitochondriální membránový potenciál a aktivaci C-Jun-N-terminální kinázy (JNK). Zjistili jsme, že v buňkách ošetřených 25, 100 a 200 μM CdCl2 došlo k významnému zvýšení dehydrogenázové aktivity. Výsledky navíc ukázaly že po nárůstu dehydrogenázové aktivity došlo ke zvýšení produkce ROS spojené s aktivací JNK. Ostatní testy nenalezly žádný významný vztah se zvýšením intracelulární dehydrogenázové aktivity. Naše zjištění poskytují nové důkazy o nefrotoxicitě kadmia