Degeneration and Regeneration in the Vertebrate Retina

International audienceThe human retina is a complex, layered tissue responsible for the perception of the visual stimuli coming from the external environment. Since the visual inputs account for about 30% of our sensory stimulations, it is not surprising that partial or complete blindness results in a strong decrease of life quality. Several diseases affect the retina, often leading to degeneration of one or several cell types. The damage induced by these diseases is often irreversible, thus leading to a permanent loss of the visual ability. Over the last decades significant progress has been made to elucidate the molecular basis of retinal degenerative diseases. This knowledge is necessary in order to design valid approaches for the treatment of retinopathies

Ptf1a triggers GABAergic neuronal cell fates in the retina

International audienceBACKGROUND: In recent years, considerable knowledge has been gained on the molecular mechanisms underlying retinal cell fate specification. However, hitherto studies focused primarily on the six major retinal cell classes (five types of neurons of one type of glial cell), and paid little attention to the specification of different neuronal subtypes within the same cell class. In particular, the molecular machinery governing the specification of the two most abundant neurotransmitter phenotypes in the retina, GABAergic and glutamatergic, is largely unknown. In the spinal cord and cerebellum, the transcription factor Ptf1a is essential for GABAergic neuron production. In the mouse retina, Ptf1a has been shown to be involved in horizontal and most amacrine neurons differentiation. RESULTS: In this study, we examined the distribution of neurotransmitter subtypes following Ptf1a gain and loss of function in the Xenopus retina. We found cell-autonomous dramatic switches between GABAergic and glutamatergic neuron production, concomitant with profound defects in the genesis of amacrine and horizontal cells, which are mainly GABAergic. Therefore, we investigated whether Ptf1a promotes the fate of these two cell types or acts directly as a GABAergic subtype determination factor. In ectodermal explant assays, Ptf1a was found to be a potent inducer of the GABAergic subtype. Moreover, clonal analysis in the retina revealed that Ptf1a overexpression leads to an increased ratio of GABAergic subtypes among the whole amacrine and horizontal cell population, highlighting its instructive capacity to promote this specific subtype of inhibitory neurons. Finally, we also found that within bipolar cells, which are typically glutamatergic interneurons, Ptf1a is able to trigger a GABAergic fate. CONCLUSION: Altogether, our results reveal for the first time in the retina a major player in the GABAergic versus glutamatergic cell specification genetic pathway

Exploring nervous system transcriptomes during embryogenesis and metamorphosis in Xenopus tropicalis using EST analysis

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The western African clawed frog <it>Xenopus tropicalis </it>is an anuran amphibian species now used as model in vertebrate comparative genomics. It provides the same advantages as <it>Xenopus laevis </it>but is diploid and has a smaller genome of 1.7 Gbp. Therefore <it>X. tropicalis </it>is more amenable to systematic transcriptome surveys. We initiated a large-scale partial cDNA sequencing project to provide a functional genomics resource on genes expressed in the nervous system during early embryogenesis and metamorphosis in <it>X. tropicalis</it>.</p> <p>Results</p> <p>A gene index was defined and analysed after the collection of over 48,785 high quality sequences. These partial cDNA sequences were obtained from an embryonic head and retina library (30,272 sequences) and from a metamorphic brain and spinal cord library (27,602 sequences). These ESTs are estimated to represent 9,693 transcripts derived from an estimated 6,000 genes. Comparison of these cDNA sequences with protein databases indicates that 46% contain their start codon. Further annotation included Gene Ontology functional classification, InterPro domain analysis, alternative splicing and non-coding RNA identification. Gene expression profiles were derived from EST counts and used to define transcripts specific to metamorphic stages of development. Moreover, these ESTs allowed identification of a set of 225 polymorphic microsatellites that can be used as genetic markers.</p> <p>Conclusion</p> <p>These cDNA sequences permit <it>in silico </it>cloning of numerous genes and will facilitate studies aimed at deciphering the roles of cognate genes expressed in the nervous system during neural development and metamorphosis. The genomic resources developed to study <it>X. tropicalis </it>biology will accelerate exploration of amphibian physiology and genetics. In particular, the model will facilitate analysis of key questions related to anuran embryogenesis and metamorphosis and its associated regulatory processes.</p

Etude des mécanismes de maintenance et de spécification des cellules souches et progénitrices de la rétine du xénope

Au cours de ma thèse, mes projets de recherche ont visé à mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la prolifération et la spécification des cellules progénitrices dans la rétine du xénope à travers trois projets principaux. Le réseau de régulation qui contrôle la spécification des cellules progénitrices vers les sous-types neuronaux est à ce jour très peu connu. C est dans ce contexte que j ai étudié le rôle du facteur de transcription à domaine bHLH, Ascl1, dans la détermination des sous-types rétiniens au cours du développement. Par des approches in vivo de gain et perte de fonction d Ascl1, des expériences d épistasie et la recherche de ses cibles transcriptionnelles, j ai pu mettre en évidence qu Ascl1 (i) est impliqué dans la genèse des neurones GABAergiques rétiniens, (ii) qu il est épistatique sur des facteurs glutamatergiques tels que Neurog2, NeuroD1 ou Atoh7, (iii) que son activité GABAergique est conférée par son domaine basique de liaison à l ADN et (iv) que cette activité implique la régulation directe du facteur de transcription Ptf1a. Ces données ajoutent donc une nouvelle pièce au réseau transcriptionnel gouvernant la spécification des sous-types GABAergiques au cours du développement de la rétine. La mise en place correcte des types et sous-types cellulaires de la rétine nécessite une coordination avec le moment de sortie du cycle cellulaire des progéniteurs rétiniens. Dans ce contexte, j ai contribué à l avancée d un projet visant à étudier le réseau de signalisation contrôlant la prolifération des précurseurs de la rétine. Par des approches in vivo, génétiques et pharmacologiques, cette étude a montré que les voies Wnt et Hedgehog s antagonisent pour réguler l activité proliférative des cellules souches et progénitrices rétiniennes. Nos données préliminaires suggèrent que ces voies agissent de façon opposée à la fois sur la sortie et sur la cinétique du cycle cellulaire. Ce travail nous a conduit à proposer un modèle selon lequel ces voies Wnt et Hedgehog réguleraient la balance entre prolifération et différenciation dans la rétine post-embryonnaire. Enfin, dans le but d élargir nos connaissances sur les réseaux de signalisation et les réseaux transcriptionnels impliqués dans le contrôle de la prolifération et de la détermination cellulaire dans la rétine, j ai également contribué à la recherche de nouveaux marqueurs spécifiques des différentes populations cellulaires rétiniennes au travers d un crible à grande échelle par hybridation in situ. De nombreux gènes spécifiquement exprimés dans les cellules souches ou les cellules progénitrices constituent des gènes candidats pour de futures approches fonctionnelles.My thesis research work aimed to better understand the molecular mechanisms underlying proliferation and specification of retinal progenitors in Xenopus through three main projects. As the mechanisms governing specification of retinal progenitors towards the different neuronal subtypes are still poorly understood, I focused my work on the role of Ascl1, a bHLH transcription factor, in cell-subtype determination during retinogenesis. Using in vivo gain- and loss-of-function experiments, I have investigated Ascl1 s epistatic relationships with other bHLH factors and identified its transcriptional targets. My results indicate that Ascl1 (i) is implicated in the genesis of retinal GABAergic neurons (ii) is epistatic to glutamatergic factors such as Neurog2, NeuroD1 and Atoh7 (iii) that its basic DNA-biding domain is sufficient for its GABAergic-inducing activity (iv) and that this activity involves a direct regulation of the Ptf1a transcription factor. The correct order of neural cell types and subtypes formation is tightly coordinated with the timing of cell-cycle exit of retinal progenitors. Ongoing work in the laboratory, to which I have contributed, was therefore investigating the role of signaling pathways controlling retinal precursor proliferation in this process. Using in vivo genetic and pharmacological tools, we have shown that an antagonistic cross-regulation between Wnt and Hedgehog signaling governs stem cell and progenitor proliferation in post-embryonic retina. Preliminary data shows that Wnt and Hedgehog have opposite effects on both cell cycle exit and kinetics and may therefore regulate the proliferation/differentiation balance in the post-embryonic retina. Lastly, in order to broaden our knowledge on the transcriptional and signaling networks which govern proliferation and cell fate determination in the retina, I have participated in a large scale screen by in situ hybridization aiming to identify new molecular markers of different retinal cell population. Many genes that are exclusively expressed in retinal stem cells or progenitors are promising candidates for future functional studies.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Etude de facteurs transcriptionnels et post-transcriptionnels impliqués dans la spécification des cellules rétiniennes chez Xenopus laevis

La rétine est un modèle très utilisé pour étudier la neurogenèse chez les vertébrés car elle est organisée simplement en trois couches et contient peu de types cellulaires. De nombreux facteurs de transcriptions ont été impliqués dans la rétinogenèse et parmi eux les facteurs bHLH jouent un rôle important. Les activateurs bHLH activent la différenciation des rétinoblastes tout en favorisant la formation des neurones et en contrôlant leur spécification. Les bHLH répresseurs de leur côté tendent à restreindre la différentiation des rétinoblastes et à promouvoir la gliogenèse.Au cours de ma thèse, j ai recherché des facteurs post-transcriptionnels impliqués dans la rétinogenèse puisque jusqu à présent les seuls régulateurs géniques connus pour êtres impliqués dans ce processus étaient des facteurs de transcription. Je me suis plus particulièrement intéressé à l un d eux, une protéine liant l ARN potentielle nommée XSEB4R. Par des expériences de surexpression et de perte de fonction, j ai pu montrer que le gène Xseb4R était impliqué dans la rétinogenèse et qu il avait une fonction proche de celle des bHLH activateurs. J ai par ailleurs montré que certains de ces facteurs se trouvaient en amont de Xseb4R. Je me suis aussi intéressé à un autre nouveau gène, Xhes2 (Hairy Enhancer of Split), dont j ai aussi mis en évidence la fonction durant la rétinogenèse. Ce gène codant un répresseur bHLH en plus de favoriser la gliogenèse comme d autres gènes de cette famille, a aussi un rôle sur la spécificité neuronale. J ai enfin aussi participé à la mise en évidence du rôle de la cascade hh dans le développement de l épithélium pigmenté rétinien, tissu contiguë à la rétine neurale.Retina is an interesting model to study vertebrate neurogenesis because it is simply organised in three layers and contains only few cell types. Numerous transcription factors are involved in retinogenesis. Among them, bHLH factors play important roles. bHLH activators promote neural differentiation, neurons formation and specification. bHLH repressors tend to limit neuroblasts differentiation and promote gliogenesis.During my thesis, I aimed to isolate post-transcriptionnal factors involved in retinogenesis since genetic regulators so far known to be involved in this process are all transcription factors. I have focused my studies on one of them, a new putative RNA binding protein called XSEB4R. Using overexpression and loss of function experiments, I have shown that Xseb4R is involved in retinogenesis and has a function related to bHLH activators function. I have also shown that some of these factors are upstream Xseb4R. During my thesis, I have also been interested in another novel gene, Xhes2 (Hairy Enhancer of Split). I highlighted that, in addition to promote gliogenesis, as other genes of this family, it also controls neuronal specificity. I have also participated to the determination of the function of the Hedgehog cascade in the development of retinal pigmented epithelium, which is adjacent to neural retina.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Diversité neuronale au sein de la rétine (Etude de régulateurs transcriptionnels et post-transcriptionnels)

LE KREMLIN-B.- PARIS 11-BU Méd (940432101) / SudocSudocFranceF

Etude du rôle de la cascade Hedgehog dans la prolifération des cellules souches rétiniennes chez Xenopus laevis

Au cours de ma thèse, je me suis j'ai analysé le rôle de la cascade Hedgehog (Hh) dans la prolifération des cellules souches et des précurseurs, en utilisant comme modèle la rétine de xénope. Ce modèle constitue un observatoire privilégié pour l étude du système nerveux grâce à son accessibilité et sa relativement simple organisation ainsi qu à la présence d un nombre limité de types cellulaires, ainsi que par la présence, pendant toute la vie de l animal, d une population de cellules souches e de neuroblastes en différentiation. Nous avons démontré que les gènes appartenant à la voie Hh, Gli2, Gli3 et Smoothened s expriment de façon spécifique dans les cellules souches de la rétine de xénope. En outre, les résultats obtenus ont démontré que (1) les cellules souches rétiniennes ont besoin de l activité de la voie Hh pour se maintenir dans un état prolifératif. (2) La surexpression de la cascade provoque, au contraire, une hyperprolifération des cellules souches et des précurseurs ainsi (3) qu une forte augmentation des cellules de Müller, les seules cellules gliales de la rétine.Par ailleurs, je me suis intéressé aussi à un autre aspect, peu connu, du développement du système nerveux: la régulation post-transcriptionnelle. Les protéines liant l'ARN représentent les effecteurs de la régulation post-trascriptionnelle. À ce propos, nous avons analysé en détail l'expression de six protéines liant l ARN appartenant à différentes familles. Nous avons publié un article descriptif récapitulant les expressions de cinq de ces protéines dans la rétine. De plus, j'ai participé à la réalisation d'une étude du rôle de la protéine Xseb4R dans la différentiation rétinienne.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Molecular recapitulation: the growth of the vertebrate retina.

International audienceIn postembryonic lower vertebrates, the ciliary marginal zone (CMZ) of the retina is a continuously growing zone in the central nervous system. By studying the cellular and molecular biology of the cells in this region, we have discovered that the CMZ can be divided into several zones, from peripheral to central, which reflect different stages of development of retinal stem cells. Based on the behavior of the cells and on the genes expressed in different regions, we propose here that cellular development in the CMZ recapitulates in space what happens in embryonic retinal development in time