Separation and quantification of milk proteins with the addition of cheese whey by lab-on-a-chip

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eletroforese com dispositivo de microfluidos, conhecida como técnica lab-on-a-chip, para detecção de adulteração de leite com soro de queijo, em comparação ao SDS-PAGE. Amostras de leite cru, pasteurizado, processado em temperatura ultra-alta (UHT) e em pó receberam adição de soro de queijo em concentrações crescentes (0, 1, 2,5, 5, 10, 20, 30, 50 e 100% v/v) e foram submetidas a eletroforese lab-on-a-chip e SDS-PAGE para detectar suas misturas. A metodologia lab-on-a-chip foi capaz de separar e quantificar as proteínas do leite. Além disso, a técnica lab-on-a-chip é fácil, rápida, sensível e pode detectar adição de soro de queijo no leite do nível mais baixo testado (1%) para as proteínas do leite α-caseína e β-caseína.The objective of this work was to evaluate microfluidic chip electrophoresis, known as lab-on-a-chip technique, for the detection of milk adulteration using cheese whey in comparison with SDS-PAGE. Raw, pasteurized, processed at an ultra-high temperature (UHT), and powdered milk samples received increasing concentrations of cheese whey (0, 1, 2.5, 5, 10, 20, 30, 50, and 100% v/v), and were subjected to lab-on-a-chip electrophoresis and SDS-PAGE to detect their mixtures. The lab-on-a-chip methodology was able to separate and quantify milk proteins. In addition, the tested technique is easy, rapid, sensitive, and can detect the addition of cheese whey in milk from the lowest level tested (1%) for milk proteins α-casein and β-casein

Avaliação e caracterização de bacteriófagos líticos e suas endolisinas recombinantes para controle de Staphylococcus aureus na cadeia produtiva do leite

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Análises funcionais in silico de genes diferencialmente expressos em resposta a infecção por Streptococcus agalactiae em úberes extracorpóreos bovinos

Mastitis is an inflammatory response of the mammary gland characterized by an influx of somatic cells, composed mainly of neutrophils, macrophages and lymphocytes, in response to infection by pathogens. The speed and efficacy of the host immune response to pathogens affect the establishment, persistence, and severity of the infection. Among the pathogens that cause mastitis, Streptococcus agalactiae is one of the major and in cattle, the only disease associated with Streptococcus agalactiae infection is mastitis. It is known that biological pathways related to the development and occurrence of mastitis and the immune response of the host are concentrated in the mammary gland. In this sense, gene expression studies have been used to better understand their genetic basis and the development of genetic improvement strategies. In previous studies, a group of differentially expressed genes in response to Streptococcus agalactiae infection in bovine extracorporeal udders was identified using the Seq RNA technique. In the present study, we investigated which transcription factors and miRNAs are more related to differentially expressed genes in the mammary tissue, contributing to the understanding of the molecular mechanisms related to the development of mastitis. Genetic networks related to the inflammatory response were established in crossbred bovine extracorporeal udders infected with Streptococcus agalactiae. Genes (TRL2, CD14, CXCL8 and CCL5) that are part of important biological processes for the inflammatory response, such as cellular response to triacylated bacterial lipopeptide, cellular response to bacterial lipoprotein, cellular response to molecules of bacterial origin, TLR4 signaling pathways and response cell by IL1 were identified. In addition, the gene-FT network analysis allowed to highlight genes (LOC515333, SAA3, CD14, NFKBIA, APOC2 and LOC100335608) and transcription factors (STAT3, PPARG, EGR1 and NFKB1) with biological roles related to the immune response. It was also possible to highlight which genes could be regulated post-transcriptionally by miRNAs, through analysis of the gene-miRNA network, as evidenced by the relationship between the CCL5 gene and the miRNA bta-miR-363. From these functional analyzes, it was possible to identify genes and regulatory elements of the gene expression (FT and miRNA) with evident relation in the inflammatory processes of mammary glands infected by Streptococcus agalactiae and thus, possible candidate genes for mastitis resistance in cattle were presented.A mastite é uma resposta inflamatória da glândula mamária caracterizada por um influxo de células somáticas, compostas principalmente por neutrófilos, macrófagos e linfócitos, em resposta à infecção por patógenos. A velocidade e a eficácia da resposta imune do hospedeiro a patógenos afetam o estabelecimento, a persistência e a gravidade da infecção. Dentre os patógenos causadores da mastite, o Streptococcus agalactiae é um dos principais e em bovinos, a única doença associada à infecção por Streptococcus agalactiae é a mastite. Sabe-se que vias biológicas relacionadas ao desenvolvimento e ocorrência da mastite e a resposta imunológica do hospedeiro, estão concentradas na glândula mamária. Neste sentido, estudos de expressão gênica têm sido empregados para melhor compreensão de suas bases genéticas e desenvolvimento de estratégias de melhoramento genético. Em trabalhos anteriores, foi identificado um grupo de genes diferencialmente expressos em resposta a infecção por Streptococcus agalactiae em úberes extracorpóreos bovinos utilizando a técnica de RNA-Seq. No presente estudo, foram investigados quais fatores de transcrição e miRNAs estão mais relacionados com os genes diferencialmente expressos no tecido mamário, contribuindo para o entendimento dos mecanismos moleculares relacionados ao desenvolvimento da mastite. Foram estabelecidas redes gênicas relacionadas à resposta inflamatória em úberes extracorpóreos bovinos mestiços infectados por Streptococcus agalactiae. Genes (TRL2, CD14, CXCL8 e CCL5) que fazem parte de importantes processos biológicos para a resposta inflamatória, como resposta celular ao lipopeptídeo bacteriano triacilado, resposta celular a lipoproteína bacteriana, resposta celular a moléculas de origem bacteriana, vias de sinalização TLR4 e reposta celular por IL1 foram identificados. Além disso, a análise de rede gene-FT permitiu destacar genes (LOC515333, SAA3, CD14, NFKBIA, APOC2 e LOC100335608) e fatores de transcrição (STAT3, PPARG, EGR1 e NFKB1) também com papéis biológicos relacionados à resposta imune. Foi possível também, destacar quais eram os genes que podem ser regulados pós-transcricionalmente por miRNAs, por meio da análise da rede gene-miRNA, como evidenciado pela relação entre o gene CCL5 e o miRNA bta-miR-363. A partir destas análises funcionais, foi possível identificar genes e elementos regulatórios da expressão gênica (FT e miRNA) com evidente relação nos processos inflamatórios de glândulas mamarias infectadas por Streptococcus agalactiae e assim, possíveis genes candidatos para resistência a mastite em bovinos foram apresentados

Lytic bacteriophages as a potential alternative to control Staphylococcus aureus

O objetivo deste trabalho foi caracterizar bacteriófagos autóctones e determinar sua atividade lítica em Staphylococcus aureus. Seis fagos foram isolados de água de lavagem de pisos de estábulos por meio do enriquecimento de cultura com três estirpes de S. aureus. Todos os fagos foram caracterizados pela digestão do DNA com enzimas de restrição e pelo sequenciamento do fragmento de DNA que codifica a endolisina. Cada fago foi testado contra 100 estirpes de S. aureus isoladas de casos de mastite bovina e de produtos lácteos pelo método de lise em placa. Sequências do gene de endolisina apresentaram alta conservação, com mais de 99% de similaridade a nível do nucleotídeo entre os fagos isolados. Foram identificados três domínios envolvidos no reconhecimento e na lise da parede celular bacteriana. Dois bacteriófagos isolados de estábulos apresentam alta atividade lítica em S. aureus, em ampla gama de estirpes, o que indica seu potencial para estudos de fagoterapia em gado leiteiro ou como agente de controle biológico para produtos lácteos.The objective of this work was to characterize autochthonous bacteriophages and to determine their lytic activity on Staphylococcus aureus. Six phages were isolated from dairy barn flush water through enrichment cultures with three S. aureus strains. All phages were characterized by DNA digestion by restriction enzymes and sequencing of the DNA fragment encoding endolysin. Each phage was tested against 100 S. aureus strains isolated from bovine mastitis and from dairy products using the lysis-plate method. The sequences of the endolysin gene were highly conserved, with nucleotide similarity higher than 99% among the isolated phages. Three domains involved in the recognition and lysis of the bacterial cell wall were identified. Two bacteriophages isolated from the dairy barns present high lytic activity on S. aureus, on a wide range of host strains, indicating their potential for studies on phage therapy in dairy cattle or as a biological control agent for dairy products

Lipopolysaccharide triggers different transcriptional signatures in taurine and indicine cattle macrophages: Reactive oxygen species and potential outcomes to the development of immune response to infections.

Macrophages are classified upon activation as classical activated M1 and M2 anti-inflammatory regulatory populations. This macrophage polarization is well characterized in humans and mice, but M1/M2 profile in cattle has been far less explored. Bos primigenius taurus (taurine) and Bos primigenius indicus (indicine) cattle display contrasting levels of resistance to infection and parasitic diseases such as C57BL/6J and Balb/c murine experimental models of parasite infection outcomes based on genetic background. Thus, we investigated the differential gene expression profile of unstimulated and LPS stimulated monocyte-derived macrophages (MDMs) from Holstein (taurine) and Gir (indicine) breeds using RNA sequencing methodology. For unstimulated MDMs, the contrast between Holstein and Gir breeds identified 163 Differentially Expressed Genes (DEGs) highlighting the higher expression of C-C chemokine receptor type five (CCR5) and BOLA-DQ genes in Gir animals. LPS-stimulated MDMs from Gir and Holstein animals displayed 1,257 DEGs enriched for cell adhesion and inflammatory responses. Gir MDMs cells displayed a higher expression of M1 related genes like Nitric Oxide Synthase 2 (NOS2), Toll like receptor 4 (TLR4), Nuclear factor NF-kappa-B 2 (NFKB2) in addition to higher levels of transcripts for proinflammatory cytokines, chemokines, complement factors and the acute phase protein Serum Amyloid A (SAA). We also showed that gene expression of inflammatory M1 population markers, complement and SAA genes was higher in Gir in buffy coat peripheral cells in addition to nitric oxide concentration in MDMs supernatant and animal serum. Co-expression analyses revealed that Holstein and Gir animals showed different transcriptional signatures in the MDMs response to LPS that impact on cell cycle regulation, leukocyte migration and extracellular matrix organization biological processes. Overall, the results suggest that Gir animals show a natural propensity to generate a more pronounced M1 inflammatory response than Holstein, which might account for a faster immune response favouring resistance to many infection diseases