Diseño de herramientas bioquímicas para la ingeniería molecular de derivados inmovilizados de Renina y Beta-Galactosidasa

En esta tesis se han abordado los problemas relacionados con la preparación de derivados de renina y lactasa que pudieran ser útiles como catalizadores en tecnología de la leche. Es decir, derivados donde todas las enzimas estén muy fuertemente unidos al soporte para que no se produzca liberación de las enzimas ni de sus subunidades en el alimento, derivados de la renina muy activos frente a un substrato macromolecular como la k-caseina y derivados de diferentes -galactosidasas (glicosiladas, dimericas, tetramericas) muy activos y altamente estabilizados. Se desarrollaron nuevos métodos bioquímico físicos de modificación de proteínas vía fase sólida. Es decir, modificaciones para modular la actividad y estabilidad de la enzima íntimamente asociados a su proceso de inmovilización: modificaciones de las enzimas durante y después de la inmovilización e incluso modificaciones previas pero siempre dirigidas a optimizar la inmovilización y la modificación posterior. Los resultados más significativos son los siguientes: i.- la utilización de soportes que promovían pocos impedimentos estéricos y la inmovilización de la renina a través de sus cadenas glicosiladas como brazos espaciadores pudimos obtener derivados inmovilizados que conservaban el 33% de su actividad caseinolítica, ii.- la combinación de un proceso de animación controlada de la -galactosidasa de aspergillus y el diseño de procesos de unión multipuntual y entrecruzamiento con cadenas glicosiladas nos permite estabilizaciones de 1000 veces con respecto a la enzima aminada y de más de 20 veces con respecto a la enzima nativa y iii.- la estabilización conjunta de estructura cuaternaria y estructura terciaria que hemos logrado por inmovilización multipuntual de la -galactosidasa de kluyveromices fragilis sobre geles de agarosa nos permitió preparar derivados mas de 1000 veces mas estables que la enzima nativ

Stabilization of multimeric enzymes via immobilization and post-immobilization techniques

9 páginas, 3 figuras, 3 esquemas, 2 tablas.-- et al.Controlled and directed immobilization plus post-immobilization techniques are proposed to get full stabilization of the quaternary structure of most multimeric industrial enzymes. The sequential utilization of two stabilization approaches is proposed: (a) Multi-subunit immobilization: a very intense multi-subunit covalent immobilization has been achieved by performing very long immobilization processes between multimeric enzymes and porous supports composed by large internal surfaces and covered by a very dense layer of reactive groups secluded from the support surface through very short spacer arms. (b) Additional cross-linking with poly-functional macromolecules: additional chemical modification of multi-subunit immobilized derivatives with polyfunctional macromolecules promotes an additional cross-linking of all subunits of most of multimeric enzymes. A number of homo and hetero-dimeric enzymes has been stabilized by the simple application of multi-subunit immobilization but more complex multimeric enzymes (e.g., tetrameric ones) were only fully stabilized after the sequential application of both strategies. After such stabilization of the quaternary structure these three features were observed: no subunits were desorbed from derivatives after boiling them in SDS, thermal inactivation becomes independent from enzyme concentration and derivatives became much more stable than soluble enzymes as well as than non-stabilized derivatives. For example, thermal stability of -amino acid oxidase from Rhodotorula gracilis was increased 7.000 fold after stabilization of its quaternary structure.This work has been partially supported by grants from Resindion S.R.L. (Mitsubishi Chemical Corporation), from Comunidad Autonoma de Madrid and from Agencia Española de Cooperacion Internacional.Peer reviewe