Atorvastatin Promotes Phagocytosis and Attenuates Pro-Inflammatory Response in Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Phagocytosis of daily shed photoreceptor outer segments is an important function of the retinal pigment epithelium (RPE) and it is essential for retinal homeostasis. RPE dysfunction, especially impairment of its phagocytic ability, plays an essential role in the pathogenesis of age-related macular degeneration (AMD). Statins, or HMG CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A) reductase inhibitors, are drugs with multiple properties that have been extensively used to treat hyperlipidemia. However, their effect on RPE cells has not been fully elucidated. Here we report that high dose atorvastatin increased the phagocytic function of ARPE-19 cells, as well as rescue the cells from the phagocytic dysfunction induced by cholesterol crystals and oxidized low-density lipoproteins (ox-LDL), potentially by increasing the cellular membrane fluidity. Similar effects were observed when evaluating two other hydrophobic statins, lovastatin and simvastatin. Furthermore, atorvastatin was able to block the induction of interleukins IL-6 and IL-8 triggered by pathologic stimuli relevant to AMD, such as cholesterol crystals and ox-LDL. Our study shows that statins, a well-tolerated class of drugs with rare serious adverse effects, help preserve the phagocytic function of the RPE while also exhibiting anti-inflammatory properties. Both characteristics make statins a potential effective medication for the prevention and treatment of AMD

Issues with the Specificity of Immunological Reagents for NLRP3: Implications for Age-related Macular Degeneration

Contradictory data have been presented regarding the implication of the NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3 (NLRP3) inflammasome in age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in the Western world. Recognizing that antibody specificity may explain this discrepancy and in line with recent National Institutes of Health (NIH) guidelines requiring authentication of key biological resources, the specificity of anti-NLRP3 antibodies was assessed to elucidate whether non-immune RPE cells express NLRP3. Using validated resources, NLRP3 was not detected in human primary or human established RPE cell lines under multiple inflammasome-priming conditions, including purported NLRP3 stimuli in RPE such as DICER1 deletion and Alu RNA transfection. Furthermore, NLRP3 was below detection limits in ex vivo macular RPE from AMD patients, as well as in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived RPE from patients with overactive NLRP3 syndrome (Chronic infantile neurologic cutaneous and articulate, CINCA syndrome). Evidence presented in this study provides new data regarding the interpretation of published results reporting NLRP3 expression and upregulation in RPE and addresses the role that this inflammasome plays in AMD pathogenesis

Νευροπροστατευτικές προσεγγίσεις σε πειραματικά μοντέλα νευροεκφύλισης του αμφιβληστροειδούς

BNN27, a blood-brain barrier-permeable, C17-spiroepoxy derivative of dehydroepiandrosterone (DHEA) has shown promising neuroprotective activity through interaction with nerve growth factor receptors, tropomyosin receptor kinase A (TrkA) and pan-neurotrophin receptor p75NTR. In this study, we administered systemically BNN27 in two murine models of acute retinal degeneration/injury; experimental retinal detachment (RD) that results in photoreceptor cell death and N-methyl-D-aspartate (NMDA)-induced retinal excitotoxicity that results in cell death primarily of the inner retina and the retinal ganglion cells (RGCs). TUNEL+ (Terminal deoxynucleotidyl transferase -TdT- dUTP Nick-End Labeling) photoreceptors were significantly decreased 24 hours post RD after a single administration of 200 mg/kg BNN27. Furthermore, BNN27 increased inflammatory cell infiltration, as well as, two markers of gliosis 24 hours post RD. However, single or multiple doses of BNN27 were not able to protect the overall survival of photoreceptors 7 days post injury. Additionally, BNN27 did not induce the activation/phosphorylation of TrkAY490 in the detached retina although the mRNA levels of the receptor were increased in the detached photoreceptors. In NMDA-mediated retinal injury, BNN27 was able to reduce TUNEL+ cell death only in the photoreceptors and not in the RGCs or the inner retina in any of the three doses that we tested. Furthermore, it did not induce any changes in macrophage/microglia cell infiltration or in NMDA-mediated retinal gliosis. Moreover, similarly to RD injury, BNN27 did not induce the activation/phosphorylation of TrkAY490 in the NMDA-mediated injured retina although TrkA was downregulated following NMDA insult. Together, these findings, do not demonstrate neuroprotective activity of BNN27 in experimentally-induced RD or NMDA-mediated retinal excitotoxicity. Further studies are needed in order to elucidate the paradox/contradiction of these results and the mechanism of action of BNN27 in these models of acute retinal cell damage.Το BNN27, [(R)-3β, 21-dihydroxy-17R, 20-epoxy-5-pregnene] είναι ένα συνθετικό ανάλογο της δεϋδροεπιανδροστερόνης (dehydroepiandrosterone, DHEA), το οποίο έχει δείξει σημαντική αντί-αποπτωτική δράση (είδος κυτταρικού θανάτου) σε καλλιέργειες πρωτογενών νευρώνων, μέσω της πρόσδεσης του στους υποδοχείς της νευροτροφίνης nerve growth factor (NGF), tropomyosin kinase receptor A (TrkA) και pan-neurotrophin receptor p75NTR. Το καινοτόμο αυτό στεροειδές είναι ένα μικρό, λιπόφιλο μόριο, το οποίο διαπερνάει τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και κατ’ επέκταση μπορεί να χορηγηθεί συστηματικά. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η συστηματική χορήγηση του μορίου ΒΝΝ27 σε δύο διαφορετικά πειραματικά μοντέλα οξείας νευροεκφύλισης του αμφιβληστροειδή σε τρωκτικά (επίμυες). Το πρώτο προκλινικό μοντέλο το οποίο εξετάστηκε, και στο οποίο δόθηκε και η μεγαλύτερη βαρύτητα, ήταν η πειραματική αποκόλληση του αμφιβληστροειδή, η οποία οδηγεί στον κυτταρικό θάνατο του έξω αμφιβληστροειδή λόγω της απομάκρυνσης των φωτοϋποδοχέων (φωτοαισθητήρια κύτταρα του οφθαλμού) από το μελάγχρουν επιθήλιο και τα χοριοτριχοειδή, τα οποία είναι η μοναδική πηγή μεταβολισμού τους. Το δεύτερο μοντέλο το οποίο εξετάστηκε ήταν αυτό της N-Methyl-D-aspartate (NMDA) διεγερσιτοξικότητας, το οποίο έχει ως αποτέλεσμα τον κυτταρικό θάνατο, πρωτίστως, του έσω αμφιβληστροειδή και συγκεκριμένα των γαγγλιακών κυττάρων (τα κύτταρα των οποίων οι άξονες σχηματίζουν το οπτικό νεύρο) και κάποιων υποτύπων αμακρυνικών κυττάρων (ενδιάμεσοι νευρώνες του αμφιβληστροειδή).Τα αποτελέσματα της μελέτης μας έδειξαν ότι μία χορήγηση ΒΝΝ27 (200 mg/kg) μία ώρα μετά την επαγωγή της πειραματικής αποκόλλησης, μειώνει σημαντικά τον κυτταρικό θάνατο των TUNEL+ (Terminal deoxynucleotidyl transferase -TdT- dUTP Nick-End Labeling) φωτοϋποδοχέων 24 ώρες αργότερα. Επίσης, το ίδιο σχήμα χορήγησης, αύξησε σημαντικά τον αριθμό των CD11b+ φλεγμονωδών κυττάρων στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο και στον αμφιβληστροειδή στις 24 ώρες μετά την αποκόλληση. Συγκεκριμένα, όχι μόνο αυξήθηκε ο αριθμός των κυττάρων τα οποία εξέφραζαν τον κυτταρικό δείκτη CD11b (μακροφάγα και μικρογλοία), αλλά παρατηρήθηκε και αυξημένος αριθμός συσσωματωμάτων κυττάρων φλεγμονής στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο. Παρομοίως, υπήρξε αυξημένη έκφραση σε δύο δείκτες γλοίωσης (GFAP και vimentin) στις 24 ώρες στην ομάδα των πειραματόζωων που είχαν λάβει μία χορήγηση ΒΝΝ27 (200 mg/kg). Στη συνέχεια, οι μελέτες για την έκφραση των υποδοχέων έδειξαν ότι ο TrkA δεν εκφράζεται σε υγιείς φωτοϋποδοχείς ενώ αυξάνεται δραστικά η έκφραση του 24 ώρες μετά την αποκόλληση, σε αντίθεση με τον υποδοχέα p75NTR όπου η έκφραση του παρέμεινε σταθερή πριν και μετά τον τραυματισμό. Σχετικά με τη φωσφορυλίωση του υποδοχέα (phospho-TrkA), δεν παρατηρήθηκε κάποια σημαντική διαφορά ανάμεσα στους αποκολλημένους αμφιβληστροειδείς της ομάδας ελέγχου και της ομάδας που της είχε χορηγηθεί BNN27 (200 mg/kg), όπως δεν παρατηρήθηκε και καμία διαφορά στα επίπεδα φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών (Akt και ERK1/2) οι οποίες βρίσκονται downstream του TrkA υποδοχέα και επάγουν νευροπροστατευτική σηματοδότηση. Τέλος, διερευνήθηκε η μακροχρόνια πιθανή νευροπροστασία μέσω του ΒΝΝ27; Mία χορήγηση 200 mg/kg δεν μείωσε σημαντικά τον TUNEL+-κυτταρικό θάνατο αλλά ούτε ήταν αρκετή για να αλλάξει σημαντικά το πάχος της στιβάδας των φωτοϋποδοχέων 7 ημέρες μετά την αποκόλληση. Παρομοίως, 7 επαναλαμβανόμενες χορηγήσεις της ίδιας δόσης (200 mg/kg) δεν επέφεραν νευροπροστασία στον αμφιβληστροειδή. Επιπροσθέτως, έγινε διερεύνηση με τρεις ακόμα δόσεις (10, 50 και 100 mg/kg) με 7 επαναλαμβανόμενες χορηγήσεις αλλά ούτε αυτές οι προσεγγίσεις έφεραν κάποια σημαντική αλλαγή στη διατήρηση του πάχους του αμφιβληστροειδή. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την πιθανή νευροπροστατευτική δράση του BNN27 στο μοντέλο της NMDA διεγερσιτοξικότητας. Mία ενδοϋαλοειδική ένεση 100 nmoles NMDA είχε ως αποτέλεσμα τον οξύ και μαζικό θάνατο των κυττάρων του αμφιβληστροειδή σε όλες του τις στιβάδες 24 ώρες αργότερα. Μία χορήγηση ΒΝΝ27 σε τρεις διαφορετικές δόσεις (40, 100 και 200 mg/kg), μία ώρα μετά την ενδοϋαλοειδική ένεση, δεν κατάφερε να μειώσει (καμία από τις τρεις δόσεις) τον TUNEL+-κυτταρικό θάνατο των γαγγλιακών κυττάρων και των αμακρυνικών κυττάρων του έσω αμφιβληστροειδή, αλλά μείωσε σημαντικά (και οι τρεις δόσεις) τον TUNEL+-κυτταρικό θάνατο των φωτοϋποδοχέων. Σε αυτό το μοντέλο δεν καταφέραμε να δούμε καμία διαφορά στη διήθηση των CD11b+ φλεγμονωδών κυττάρων, στη γλοίωση του αμφιβληστροειδή (GFAP και vimentin) και στη φωσφορυλίωση του TrkA υποδοχέα ανάμεσα στην ομάδα των πειραματόζωων που είχαν λάβει ΒΝΝ27 (100 mg/kg) και στην ομάδα ελέγχου. Παρ’ όλα αυτά, παρατηρήσαμε για πρώτη φορά ότι στο μοντέλο της NMDA διεγερσιτοξικότητας η έκφραση του TrkA υποδοχέα είναι σημαντικά μειωμένη 24 ώρες μετά τον τραυματισμό.Η πολύ σημαντική μείωση του κυτταρικού θανάτου των φωτοϋποδοχέων στις 24 ώρες μετά την επαγωγή της πειραματικής αποκόλλησης υποδηλώνει ότι το ΒΝΝ27 πιθανόν να έχει σημαντική δράση στον οξύ τραυματισμό των κυττάρων αυτών, κάτι το οποίο ενισχύθηκε και από τα αποτελέσματα μας από το μοντέλο της NMDA διεγερσιτοξικότητας στο οποίο το ΒΝΝ27 μείωσε δραστικά τον κυτταρικό θάνατο αποκλειστικά των φωτοϋποδοχέων και όχι των άλλων κυττάρων του αμφιβληστροειδή. Ακόμα, στο μοντέλο της αποκόλλησης, το ΒΝΝ27 αύξησε σημαντικά τη φλεγμονή και τη γλοίωση, ενώ δεν φάνηκε να έχει κάποια επιρροή στις δύο αυτές συνιστώσες στο μοντέλο της διεγερσιτοξικότητας. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι ο ρόλος των κυττάρων της φλεγμονής και της γλοίωσης στα νευροεκφυλιστικά νοσήματα παραμένει εν μέρει κατανοητός με τους πληθυσμούς αυτούς να έχουν και ευεργετικό αλλά και βλαβερό ρόλο, οπότε περαιτέρω μελέτες χρειάζονται για την αποσαφήνιση της δράσης του ΒΝΝ27 σε αυτούς τους πληθυσμούς κυττάρων. Ακόμα, σε αντίθεση με αποτελέσματα από άλλα νευροεκφυλιστικά νοσήματα, στον οξύ τραυματισμό του αμφιβληστροειδή δεν φαίνεται να ενεργοποιείται και κατ’ επέκταση να επάγεται η φωσφορυλίωση του TrkA υποδοχέα, υποδεικνύοντας ότι το BNN27 μπορεί να δρα μέσω άλλων υποδοχέων στα συγκεκριμένα δύο μοντέλα. Η έλλειψη ενεργοποίησης του TrkA και της downstream νευροπροστατευτικής σηματοδότησης με τη σειρά της μπορεί να είναι υπεύθυνη και για την απουσία μακροχρόνιας νευροπροστασίας. Συνοψίζοντας, η παρούσα εργασία δεν ήταν ικανή να καταλήξει αν το ΒΝΝ27 έχει νευροπροστατευτική δράση σε πειραματικά μοντέλα οξέων τραυμάτων του αμφιβληστροειδή. Περεταίρω ερευνητικές προσεγγίσεις είναι απαραίτητες για να αξιολογηθεί η δυνατότητα του ΒΝΝ27 ως νευροπροστατευτικό μόριο σε αμφιβληστροειδοπάθειες οι οποίες περιλαμβάνουν αποκόλληση του αμφιβληστροειδή ή διεγερσιτοξικότητα

Quantification of BNN27, a novel neuroprotective 17‐spiroepoxy dehydroepiandrosterone derivative in the blood and retina of rodents, after single intraperitoneal administration

Abstract BNN27 is a novel 17‐spiroepoxy derivative of the neurosteroid Dehydroepiandrosterone with neuroprotective properties. The purpose of this study was the detection and quantification of BNN27 after single intraperitoneal administration, in the serum and retina of normal rodents. Forty‐two C57BL/6 mice and 48 Sprague–Dawley rats were used for the quantification of BNN27 in the blood serum and retina, respectively. BNN27 was injected intraperitoneally (i.p.) at concentrations of 100 and 30 mg/kg of body weight (b.w.), respectively. The blood was collected with retro‐orbital bleeding and the retina was isolated after enucleation at various time points. The molecule concentrations were measured with Liquid chromatography‐mass spectrometry (LC‐MS). Non‐compartmental analysis was used to determine pharmacokinetic parameters. BNN27 was found to have an elimination constant kel = 0.465 h−1 and mean residence time (MRT) 2.154 h in the mouse serum. The maximum concentration (Cmax) in the retina was detected at 2 h (tCmax) after intraperitoneal administration and was equal to 1100 ng/g. BNN27 is rapidly eliminated from both blood and retina. In the retina specifically, it is undetectable 6 h after injection. BNN27 shows a rapid systemic elimination as anticipated by its small size and lipophilicity. It is measurable in small peripheral tissues such as the rat retina, after one single i.p. injection, using a simple method such as LC‐MS. Its detection in the retina corroborates the existing biological data that the molecule crosses the blood–retinal barrier, highlighting it as a potential neuroprotective agent for retinal disease

Verteporfin-induced formation of protein cross-linked oligomers and high molecular weight complexes is mediated by light and leads to cell toxicity

Verteporfin (VP) was first used in Photodynamic therapy, where a non-thermal laser light (689 nm) in the presence of oxygen activates the drug to produce highly reactive oxygen radicals, resulting in local cell and tissue damage. However, it has also been shown that Verteporfin can have non-photoactivated effects such as interference with the YAP-TEAD complex of the HIPPO pathway, resulting in growth inhibition of several neoplasias. More recently, it was proposed that, another non-light mediated effect of VP is the formation of cross-linked oligomers and high molecular weight protein complexes (HMWC) that are hypothesized to interfere with autophagy and cell growth. Here, in a series of experiments, using human uveal melanoma cells (MEL 270), human embryonic kidney cells (HEK) and breast cancer cells (MCF7) we showed that Verteporfin-induced HMWC require the presence of light. Furthermore, we showed that the mechanism of this cross-linking, which involves both singlet oxygen and radical generation, can occur very efficiently even after lysis of the cells, if the lysate is not protected from ambient light. This work offers a better understanding regarding VP’s mechanisms of action and suggests caution when one studies the non-light mediated actions of this drug