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    Identificaci贸n y validaci贸n funcional de nuevos genes y mutaciones asociadas a la etiolog铆a de la insuficiencia ov谩rica primaria (IOP) : implicaci贸n de los genes BMP15, BMPR2, MSH4, ATG7, ATG9A y NOTCH2

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    La insuficiencia ov谩rica primaria (IOP) es una patolog铆a frecuente que afecta del 1% al 3% de las mujeres de la poblaci贸n general menores de 40 a帽os. No existen datos espec铆ficos en la poblaci贸n colombiana, lo cual ser铆a un punto importante a determinar teniendo en cuenta que se ha reportado que esta prevalencia puede variar seg煤n el origen 茅tnico de las pacientes. La IOP se caracteriza cl铆nicamente por la ausencia (amenorrea primaria) o el cese de la ovulaci贸n durante al menos cuatro meses (amenorrea secundaria), con un aumento de los valores plasm谩ticos de FSH (hormona fol铆culo estimulante). Aunque se han relacionado causas autoinmunes, metab贸licas, infecciosas e iatrog茅nicas, en la mayor铆a de los casos su etiolog铆a es desconocida, lo que sugiere posibles causas gen茅ticas. A pesar de numerosos intentos por determinar estas causas, solo algunos genes han sido relacionados funcionalmente con la etiolog铆a de esta enfermedad. En esta tesis de Doctorado se realiz贸 la identificaci贸n y la validaci贸n de nuevas variantes y/o nuevos genes asociados a la etiolog铆a de la IOP. Este trabajo de tesis se divide en dos cap铆tulos, en el primero se describe la identificaci贸n de variantes en el gen BMP15 y la evaluaci贸n de c贸mo las mutaciones en este gen contribuyen a la disfunci贸n ov谩rica. Para esto se evalu贸 el efecto de 10 mutaciones en BMP15 respecto a la producci贸n del p茅ptido maduro, la activaci贸n de la se帽alizaci贸n de la v铆a SMAD y la sinergia con GDF9. La genotipificaci贸n de BMP15 en 35 pacientes Colombianas permiti贸 la identificaci贸n de una variante nueva (c.986C>G-p.Arg329His) y una variante previamente reportada (c.581T>C, p.Phe194Ser). La evaluaci贸n funcional de estas variantes, junto con otras 8 identificadas previamente, indic贸 que las mutaciones p.Leu148Phe, p.Phe194Ser y p.Tyr235Cys, est谩n relacionadas con la reducci贸n en la producci贸n del p茅ptido maduro. Las mutaciones p.Arg138His, p.Ala180Thr y p.Arg329His redujeron la actividad de BMP15 aproximadamente cuatro veces en relaci贸n con la prote铆na WT (wild type) y las variantes p.Arg68Trp, p.Phe194Ser y p.Asn196Lys redujeron la sinergia de BMP15 con GDF9. Estos resultados sugieren que las mutaciones en BMP15 alteran la funci贸n ov谩rica por diferentes mecanismos. El segundo cap铆tulo se focaliza en la identificaci贸n de mutaciones con un efecto moderado/severo que puedan estar potencialmente relacionadas con la etiolog铆a de la IOP mediante NGS (secuenciaci贸n de siguiente generaci贸n). Se tuvieron en cuenta tres aproximaciones: la primera consisti贸 en el dise帽o de un subset de genes candidatos para la secuenciaci贸n espec铆fica de la regi贸n codificante de 70 genes, la segunda se centr贸 en la secuenciaci贸n de exoma en una familia afectada por IOP y la tercera se enfoc贸 en la secuenciaci贸n de exoma en pacientes no relacionados (casos no familiares). Estas aproximaciones permitieron la identificaci贸n de aproximadamente 60 variantes posiblemente relacionadas con la etiolog铆a de la IOP. Adicionalmente, se encontr贸 que algunas pacientes eran portadoras de al menos dos variantes en diferentes genes, este hallazgo refuerza la hip贸tesis sobre la etiolog铆a polig茅nica de esta enfermedad. Finalmente, se describe la validaci贸n funcional de algunas de las mutaciones identificadas. Estos ensayos experimentales in vitro permitieron confirmar que las mutaciones en los genes: BMPR2 (c.2960C>T-p.Ser987Phe), MSH4 (c.2355+1G>A-p.Ile743_Arg785del), ATG7 (c.1209T>A-p.Phe403Leu), ATG9A (c.2272C>T-p.Arg758Cys) y NOTCH2 (c.5411C>T-p.Ser1804L, c.6947>T-p.Ala2316Val y c.7075C>G-p.Pro2359A) modifican la funci贸n cada una de las prote铆nas WT (wild type). sugiriendo una contribuci贸n a la etiolog铆a de la IOP. La identificaci贸n de nuevos genes y de variantes potencialmente delet茅reas, as铆 como su validaci贸n a trav茅s de estudios funcionales, permiti贸 aportar nuevo conocimiento en la etiolog铆a molecular de la IOP. Estos hallazgos pueden ser utilizados para prop贸sitos diagn贸sticos y/o pron贸sticos de la enfermedad.Primary ovarian insufficiency (POI) is a frequent pathology affecting 1% - 3% of women from the general population under 40 years old. There are not specific data related Colombian population, however, this could be an interesting point to be determinate taking account the variation of POI prevalence according ethnical origin. POI is characterized by the absence (primary amenorrhea) or the cessation of ovulation (secondary amenorrhea) for at least four months, as well as high plasmatic levels of FSH (Follicle Stimulating Hormone). Autoimmune, metabolic, infectious and iatrogenic causes have been related to the disease pathogenesis. However, in the majority of cases, the aetiology remains undiscovered. Despite numerous attempts to identify these genetic causes, only a few genes have been functionally related to POI鈥檚 etiology. This Ph.D. thesis focuses on the identification and functional validation of new variants and/or new genes related to POI鈥檚 etiology. This manuscript is divided in two chapters. The first one describes the identification of new BMP15 variants and the evaluation of how these variants may contribute to ovarian dysfunction. The effect of ten BMP15 mutations in mature peptide production, activation of SMAD signaling and GDF9 synergy were assessed. The BMP15 screening on 35 Colombian patients led to the identification of a new variant (c.986C>G-p.Arg329His) and a previously reported one (c.581T>C, p.Phe194Ser) associated with POI. Assessing the expression/activity of these and other 8 BMP15 mutants allowed to describe that: (1) multiple variants, including p.Leu148Phe, p.Phe194Ser and p.Tyr235Cys reduced mature protein production; (2) other variants (p.Arg138His, p.Ala180Thr and p.Arg329His) displayed lower the activity than wild-type BMP15; and (3) some variants (p.Arg68Trp, p.Phe194Ser and p.Asn196Lys) reduced GDF9 synergy. These results showed that BMP15 mutations can disrupt ovarian function through different mechanisms. The second chapter focuses on the identification of rare variants with a moderate/severe effect potentially related to POI鈥檚 etiology. For this purpose, we used NGS (Next Generation Sequencing). We used account three approaches: the first one was performed on a gene subset (n=70). The second one was based on whole exome sequencing (WES) assays in a family affected by POI. The third one was performed using WES in non-related patients (non-familial cases). These approaches led to the identification of approximately 60 variants possibly related to POI鈥檚 etiology. Furthermore, the identification of patients with at least two mutations in different genes argued in favor of a polygenic nature of POI. Finally, we performed the functional validation of some mutations. These in vitro assays confirmed that mutations in BMPR2 (c.2960C>T-p.Ser987Phe), MSH4 (c.2355+1G>A-p.Ile743_Arg785del), ATG7 (c.1209T>A-p.Phe403Leu), ATG9A (c.2272C>T-p.Arg758Cys) and NOTCH2 (c.5411C>T-p.Ser1804L, c.6947>T-p.Ala2316Val and c.7075C>G-p.Pro2359A) genes could modify the WT protein function and suggesting contribute to POI etiology

    Identificaci贸n y validaci贸n funcional de nuevos genes y mutaciones asociadas a la etiolog铆a de la insuficiencia ov谩rica primaria (IOP) : implicaci贸n de los genes BMP15, BMPR2, MSH4, ATG7, ATG9A y NOTCH2

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    La insuficiencia ov谩rica primaria (IOP) es una patolog铆a frecuente que afecta del 1% al 3% de las mujeres de la poblaci贸n general menores de 40 a帽os. No existen datos espec铆ficos en la poblaci贸n colombiana, lo cual ser铆a un punto importante a determinar teniendo en cuenta que se ha reportado que esta prevalencia puede variar seg煤n el origen 茅tnico de las pacientes. La IOP se caracteriza cl铆nicamente por la ausencia (amenorrea primaria) o el cese de la ovulaci贸n durante al menos cuatro meses (amenorrea secundaria), con un aumento de los valores plasm谩ticos de FSH (hormona fol铆culo estimulante). Aunque se han relacionado causas autoinmunes, metab贸licas, infecciosas e iatrog茅nicas, en la mayor铆a de los casos su etiolog铆a es desconocida, lo que sugiere posibles causas gen茅ticas. A pesar de numerosos intentos por determinar estas causas, solo algunos genes han sido relacionados funcionalmente con la etiolog铆a de esta enfermedad. En esta tesis de Doctorado se realiz贸 la identificaci贸n y la validaci贸n de nuevas variantes y/o nuevos genes asociados a la etiolog铆a de la IOP. Este trabajo de tesis se divide en dos cap铆tulos, en el primero se describe la identificaci贸n de variantes en el gen BMP15 y la evaluaci贸n de c贸mo las mutaciones en este gen contribuyen a la disfunci贸n ov谩rica. Para esto se evalu贸 el efecto de 10 mutaciones en BMP15 respecto a la producci贸n del p茅ptido maduro, la activaci贸n de la se帽alizaci贸n de la v铆a SMAD y la sinergia con GDF9. La genotipificaci贸n de BMP15 en 35 pacientes Colombianas permiti贸 la identificaci贸n de una variante nueva (c.986C>G-p.Arg329His) y una variante previamente reportada (c.581T>C, p.Phe194Ser). La evaluaci贸n funcional de estas variantes, junto con otras 8 identificadas previamente, indic贸 que las mutaciones p.Leu148Phe, p.Phe194Ser y p.Tyr235Cys, est谩n relacionadas con la reducci贸n en la producci贸n del p茅ptido maduro. Las mutaciones p.Arg138His, p.Ala180Thr y p.Arg329His redujeron la actividad de BMP15 aproximadamente cuatro veces en relaci贸n con la prote铆na WT (wild type) y las variantes p.Arg68Trp, p.Phe194Ser y p.Asn196Lys redujeron la sinergia de BMP15 con GDF9. Estos resultados sugieren que las mutaciones en BMP15 alteran la funci贸n ov谩rica por diferentes mecanismos. El segundo cap铆tulo se focaliza en la identificaci贸n de mutaciones con un efecto moderado/severo que puedan estar potencialmente relacionadas con la etiolog铆a de la IOP mediante NGS (secuenciaci贸n de siguiente generaci贸n). Se tuvieron en cuenta tres aproximaciones: la primera consisti贸 en el dise帽o de un subset de genes candidatos para la secuenciaci贸n espec铆fica de la regi贸n codificante de 70 genes, la segunda se centr贸 en la secuenciaci贸n de exoma en una familia afectada por IOP y la tercera se enfoc贸 en la secuenciaci贸n de exoma en pacientes no relacionados (casos no familiares). Estas aproximaciones permitieron la identificaci贸n de aproximadamente 60 variantes posiblemente relacionadas con la etiolog铆a de la IOP. Adicionalmente, se encontr贸 que algunas pacientes eran portadoras de al menos dos variantes en diferentes genes, este hallazgo refuerza la hip贸tesis sobre la etiolog铆a polig茅nica de esta enfermedad. Finalmente, se describe la validaci贸n funcional de algunas de las mutaciones identificadas. Estos ensayos experimentales in vitro permitieron confirmar que las mutaciones en los genes: BMPR2 (c.2960C>T-p.Ser987Phe), MSH4 (c.2355+1G>A-p.Ile743_Arg785del), ATG7 (c.1209T>A-p.Phe403Leu), ATG9A (c.2272C>T-p.Arg758Cys) y NOTCH2 (c.5411C>T-p.Ser1804L, c.6947>T-p.Ala2316Val y c.7075C>G-p.Pro2359A) modifican la funci贸n cada una de las prote铆nas WT (wild type). sugiriendo una contribuci贸n a la etiolog铆a de la IOP. La identificaci贸n de nuevos genes y de variantes potencialmente delet茅reas, as铆 como su validaci贸n a trav茅s de estudios funcionales, permiti贸 aportar nuevo conocimiento en la etiolog铆a molecular de la IOP. Estos hallazgos pueden ser utilizados para prop贸sitos diagn贸sticos y/o pron贸sticos de la enfermedad.Primary ovarian insufficiency (POI) is a frequent pathology affecting 1% - 3% of women from the general population under 40 years old. There are not specific data related Colombian population, however, this could be an interesting point to be determinate taking account the variation of POI prevalence according ethnical origin. POI is characterized by the absence (primary amenorrhea) or the cessation of ovulation (secondary amenorrhea) for at least four months, as well as high plasmatic levels of FSH (Follicle Stimulating Hormone). Autoimmune, metabolic, infectious and iatrogenic causes have been related to the disease pathogenesis. However, in the majority of cases, the aetiology remains undiscovered. Despite numerous attempts to identify these genetic causes, only a few genes have been functionally related to POI鈥檚 etiology. This Ph.D. thesis focuses on the identification and functional validation of new variants and/or new genes related to POI鈥檚 etiology. This manuscript is divided in two chapters. The first one describes the identification of new BMP15 variants and the evaluation of how these variants may contribute to ovarian dysfunction. The effect of ten BMP15 mutations in mature peptide production, activation of SMAD signaling and GDF9 synergy were assessed. The BMP15 screening on 35 Colombian patients led to the identification of a new variant (c.986C>G-p.Arg329His) and a previously reported one (c.581T>C, p.Phe194Ser) associated with POI. Assessing the expression/activity of these and other 8 BMP15 mutants allowed to describe that: (1) multiple variants, including p.Leu148Phe, p.Phe194Ser and p.Tyr235Cys reduced mature protein production; (2) other variants (p.Arg138His, p.Ala180Thr and p.Arg329His) displayed lower the activity than wild-type BMP15; and (3) some variants (p.Arg68Trp, p.Phe194Ser and p.Asn196Lys) reduced GDF9 synergy. These results showed that BMP15 mutations can disrupt ovarian function through different mechanisms. The second chapter focuses on the identification of rare variants with a moderate/severe effect potentially related to POI鈥檚 etiology. For this purpose, we used NGS (Next Generation Sequencing). We used account three approaches: the first one was performed on a gene subset (n=70). The second one was based on whole exome sequencing (WES) assays in a family affected by POI. The third one was performed using WES in non-related patients (non-familial cases). These approaches led to the identification of approximately 60 variants possibly related to POI鈥檚 etiology. Furthermore, the identification of patients with at least two mutations in different genes argued in favor of a polygenic nature of POI. Finally, we performed the functional validation of some mutations. These in vitro assays confirmed that mutations in BMPR2 (c.2960C>T-p.Ser987Phe), MSH4 (c.2355+1G>A-p.Ile743_Arg785del), ATG7 (c.1209T>A-p.Phe403Leu), ATG9A (c.2272C>T-p.Arg758Cys) and NOTCH2 (c.5411C>T-p.Ser1804L, c.6947>T-p.Ala2316Val and c.7075C>G-p.Pro2359A) genes could modify the WT protein function and suggesting contribute to POI etiology

    Caracterizaci贸n de la prote铆na del cuello de las roptrias 5 en plasmodium falciparum (PfRON5)

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    El conocimiento de las prote铆nas implicadas en el proceso de invasi贸n de los merozoitos a los eritrocitos por Plasmodium es el punto de partida para el desarrollo de nuevas estrategias para controlar la malaria. Muchas de estas prote铆nas han sido estudiadas en Toxoplasma gondii, donde se han identificado las prote铆nas que pertenecen al Tight Junction (TJ), el cual permite una interacci贸n fuerte entre las membranas de la c茅lula hu茅sped y el par谩sito, necesaria para la invasi贸n parasitaria. En este g茅nero, cuatro prote铆nas del cuello de las roptrias (RON2, RON4, RON5 y RON8) y una prote铆na de micronemas (TgAMA-1) se han encontrado como parte del TJ. En Plasmodium falciparum, se han caracterizado las prote铆nas PfRON2 y PfRON4. En el presente estudio se realiza la identificaci贸n de la prote铆na PfRON5, una prote铆na de ~110 kDa que se expresa en las etapas de merozoitos y esquizontes de la cepa FCB-2 utilizando t茅cnicas de biolog铆a molecular, bioinform谩tica e inmuoqu铆mica.Gathering knowledge about the proteins involved in erythrocyte invasion by Plasmodium merozoites is the starting point for developing new strategies to control malarial disease. Many of these proteins have been studied in Toxoplasma gondii, where some belonging to the Moving Junction complex have been identified. This complex allows a strong interaction between host cell and parasite membranes, required for parasite invasion. In this genus, four rhoptry proteins (RON2, RON4, RON5 and RON8) and one micronemal protein (TgAMA-1) have been found as part of the complex. In Plasmodium falciparum, RON2 and RON4 have been characterized. In the present study, we identify PfRON5, a ~110 kDa protein which is expressed in merozoite and schizont stages of the FCB-2 strain using techniques of molecular biology, bioinformatics and inmuochemistry.Fundaci贸n Instituto de Inmunolog铆a de Colombi

    Caracterizaci贸n de la prote铆na del cuello de las roptrias 5 en plasmodium falciparum (PfRON5)

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    El conocimiento de las prote铆nas implicadas en el proceso de invasi贸n de los merozoitos a los eritrocitos por Plasmodium es el punto de partida para el desarrollo de nuevas estrategias para controlar la malaria. Muchas de estas prote铆nas han sido estudiadas en Toxoplasma gondii, donde se han identificado las prote铆nas que pertenecen al Tight Junction (TJ), el cual permite una interacci贸n fuerte entre las membranas de la c茅lula hu茅sped y el par谩sito, necesaria para la invasi贸n parasitaria. En este g茅nero, cuatro prote铆nas del cuello de las roptrias (RON2, RON4, RON5 y RON8) y una prote铆na de micronemas (TgAMA-1) se han encontrado como parte del TJ. En Plasmodium falciparum, se han caracterizado las prote铆nas PfRON2 y PfRON4. En el presente estudio se realiza la identificaci贸n de la prote铆na PfRON5, una prote铆na de ~110 kDa que se expresa en las etapas de merozoitos y esquizontes de la cepa FCB-2 utilizando t茅cnicas de biolog铆a molecular, bioinform谩tica e inmuoqu铆mica.Gathering knowledge about the proteins involved in erythrocyte invasion by Plasmodium merozoites is the starting point for developing new strategies to control malarial disease. Many of these proteins have been studied in Toxoplasma gondii, where some belonging to the Moving Junction complex have been identified. This complex allows a strong interaction between host cell and parasite membranes, required for parasite invasion. In this genus, four rhoptry proteins (RON2, RON4, RON5 and RON8) and one micronemal protein (TgAMA-1) have been found as part of the complex. In Plasmodium falciparum, RON2 and RON4 have been characterized. In the present study, we identify PfRON5, a ~110 kDa protein which is expressed in merozoite and schizont stages of the FCB-2 strain using techniques of molecular biology, bioinformatics and inmuochemistry.Fundaci贸n Instituto de Inmunolog铆a de Colombi
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