Induction of viable but nonculturable state in Staphylococcus aureus biofilms obtained in vitro

Staphylococcus aureus è uno dei più importanti patogeni umani. Può causare patologie di diversa gravità, tossinfezioni alimentari ed infezioni sistemiche. Molti ceppi sono capaci di sviluppare biofilm, cioè una matrice esopolisaccaridica (slime) adesa ad una superficie, all’interno della quale rimangono inglobati i microrganismi produttori. Gli stafilococchi produttori di biofilm sono frequentemente coinvolti nelle infezioni associate all’uso di dispositivi medici impiantabili, come cateteri venosi centrali. Tali infezioni risultano difficili da eradicare in quanto i batteri risultano protetti sia dai sistemi di difesa dell’ospite che dalla terapia antibiotica. All’interno del biofilm, al contempo, i microrganismi trovano condizioni ambientali sfavorevoli come la carenza di ossigeno e di nutrienti in grado di indurre la trasformazione in forme quiescenti, tra cui lo stato VBNC (Viable But NonCulturable). Le forme VBNC rappresentano una strategia di sopravvivenza delle cellule batteriche non sporulanti sottoposte a stress ambientali, come variazioni di temperatura, luce solare, concentrazione di ossigeno e carenza di nutrienti. Sono caratterizzate da assenza di coltivabilità nei classici terreni di coltura, attività metabolica ridotta, modificazioni morfo-funzionali e dalla capacità di recuperare la capacità replicativa (resuscitation), quando le condizioni tornano favorevoli. Sono state descritte per diverse specie, soprattutto ambientali, ed anche per patogeni umani, ma la possibilità per gli stafilococchi di entrare in uno stato VBNC non è stata mai dimostrata. Questa attività di ricerca è stata rivolta a valutare la possibilità che S. aureus possa entrare in uno stato vitale ma non coltivabile, capace di resuscitation, quando si trova all’interno di biofilm. A tale scopo sono stati allestiti modelli di biofilm in vitro del ceppo S. aureus 10850 (forte produttore di slime) e in parallelo di S. aureus ATCC 25923 (non produttore di slime) e sottoposti a condizioni di stress, in particolare carenza di nutrienti associata o meno alla presenza di vancomicina, synercid o daptomicina (antibiotici utilizzati per contrastare le infezioni gravi sostenute da S. aureus) in concentrazioni pari o superiori (4x, 8x, 16x) alla minima inibente (MIC). La presenza di cellule vitali nei campioni non più coltivabili è stata valutata mediante microscopia in epifluorescenza e citometria a flusso dopo colorazione live-dead con i fluorocromi SYBR Green I e Ioduro di propidio; la capacità di espressione genica delle forme VBNC rilevate è stata analizzata mediante saggi di RT-PCR e Real-time RT-PCR specifici per il 16SrDNA batterico e per i geni glsF e nuc, il primo housekeeping specie-specifico per S. aureus e il secondo codificante per un fattore di virulenza. E’ stata inoltre valutata la possibilità delle forme VBNC di recuperare l’attività replicativa (resuscitation) ricreando condizioni di crescita favorevoli. I risultati ottenuti hanno dimostrato che (i) S. aureus è in grado di entrare in uno stato VBNC, ma solo all’interno di biofilm. Infatti forme VBNC sono state ottenute solo con il ceppo produttore di biofilm S. aureus 10850, mentre non è stato possibile rilevare la presenza di cellule vitali ma non coltivabili di S. aureus ATCC 25923; ii) condizioni di starvation in presenza di basse concentrazioni di vancomicina, synercid o daptomicina possono indurre lo stato VBNC; (iii) nello stato non coltivabile le cellule di S. aureus mantengono un’attività metabolica, come dimostrato dall’espressione di tutti i geni analizzati e che (iv) le forme VBNC di S. aureus sono in grado di riacquisire la capacità replicativa se poste in presenza di terreni di coltura addizionati di metaboliti essenziali per lo sviluppo cellulare, come il piruvato di sodio o il filtrato di una brodocoltura del ceppo wild-type S. aureus 10850. Questi risultati indicano che le forme VBNC di stafilococco potrebbero avere un ruolo rilevante in patologia umana in quanto capaci di rimanere latenti, e non evidenziabili con i comuni test colturali, all’interno del biofilm, ed essere causa di infezioni ricorrenti in seguito al recupero della piena attività metabolica e della conseguente capacità di moltiplicarsi

Detection of viable but non-culturable staphylococci in biofilms from central venous catheters negative on standard microbiological assays

none7To our knowledge this is the first evidence that S. epidermidis and S. aureus can enter the VBNC state. If positively documented, their ability to persist in this state could help to explain the well-known prevalence of both species in recurrent CVC-related infections [4,8,17,18]. Detection of S. epidermidis in 62% of CVCs demonstrated to contain non-culturable bacteria (removed from febrile patients, 27% of whom also had a positive blood culture) supports this hypothesis. Further research into the relationship among VBNC forms found in CVC-associated biofilms, their actual metabolic activity and recurrent infection, as well as careful recording of concurrent clinical data, are required to gain insights into the possible role of VBNC bacterial cells in indwelling medical device-related persistent infections.G. Zandri;S. Pasquaroli;C. Vignaroli;S. Talevi;E. Manso;G. Donelli;F. BiavascoG., Zandri; Pasquaroli, Sonia; Vignaroli, Carla; S., Talevi; E., Manso; G., Donelli; Biavasco, Francesc

Erythromycin- and copper-resistant Enterococcus hirae from marine sediment and co-transfer of erm(B) and tcrB to human Enterococcus faecalis.

An erythromycin-, copper- and cadmium-resistant isolate of Enterococcus hirae from marine sediment was shown to harbor the plasmid pRE25 and to co-transfer erm(B) and tcrB to Enterococcus faecalis JH2-2. These data highlight the scope for antibiotic resistance selection by the marine environment through heavy metals and its possible involvement in antibiotic-resistant enterococcal infections

Antibiotic-Resistant Enterococci in Seawater and Sediments from a Coastal Fish Farm

none5The aim of this study was to detect and characterize antibiotic-resistant enterococci in seawater and sediment from a Mediterranean aquaculture site where no antibiotics are used. Colonies (650) grown on Slanetz-Bartley (SB) agar were amplified on antibiotic-supplemented SB, and erythromycin (ERY), tetracycline (TET), and ampicillin (AMP) MICs were determined. Of 75 resistant isolates (17 to TET, 5 to ERY, and 45 to AMP), 5 Enterococcus faecalis, 25 E. faecium, 5 E. casseliflavus, 1 E. gallinarum, 1 E. durans, and 23 Enterococcus spp. were identified by genus- and species-specific polymerase chain reaction (PCR). tet(M), tet(O), tet(L), tet(K), erm(B), erm(A), erm(C), mef, msr, blaZ, and int(Tn916) were sought by PCR, including an improved multiplex PCR assay targeting tet(M), tet(L), and erm(B). Tet(M) was the most frequent TET resistance gene; msr(C) was the sole ERY resistance gene detected. blaZ was found in 29/45 AMP-resistant isolates; however, no b-lactamase production was detected. Antibiotic-resistant enterococci were recovered 2km off the coast despite the absence of selective pressure exerted by antibiotic use. The occurrence of resistant strains in the absence of the tested genes may indicate the presence of less common resistance determinants. This first evidence of resistant enterococci at a Mediterranean aquaculture site suggests the existence of a marine reservoir of antibiotic resistances potentially transmissible to virulent strains that could be affected by mariculture in an antibiotic-independent manner.Andrea Di Cesare;Carla Vignaroli;Gian Marco Luna;Sonia Pasquaroli;Francesca BiavascoDI CESARE, Andrea; Vignaroli, Carla; Gian Marco, Luna; Pasquaroli, Sonia; Biavasco, Francesc

Antibiotic pressure can induce the viable but nonculturable state in Staphylococcus aureus growing in biofilms

Objectives: Staphylococcal biofilms are among the main causes of chronic implant-associated infections. We have recently suggested that their transformation into viable but non-culturable (VBNC) forms (i.e. forms capable of resuscitation) could be responsible for the recurrent symptoms. This work aims to establish whether Staphylococcus aureus biofilms can give rise to VBNC forms capable of being resuscitated in suitable environmental conditions, the role of different stressors in inducing the VBNC state and the conditions favouring resuscitation. Methods: S. aureus 10850 biofilms were exposed to different concentrations of antibiotic (vancomycin or quinupristin/ dalfopristin) and/or to nutrient depletion until loss of culturability. The presence of viable cells and their number were examined by epifluorescence microscopy and flow cytometry. Gene expression was measured by real-time PCR. Resuscitation ability was tested by growth in rich medium containing antioxidant factors. Results: Viable subpopulations were detected in all non-culturable biofilms. However, viable cell numbers and gene expression remained constant for 150 days from loss of culturability in cells from antibiotic-exposed biofilms, but not in those that had only been starved. Resuscitation was obtained in rich medium supplemented with 0.3% sodium pyruvate or with 50% filtrate of a late-log culture. Conclusions: Our findings demonstrate that S. aureus can enter the VBNC state in infectious biofilms. The presence of vancomycin or quinupristin/dalfopristin can inadvertently induce a true VBNC state or its persistence in S. aureus cells embedded in biofilms, supporting previous findings on the role of staphylococcal biofilms in recurrent infection

Epidemic Escherichia coli ST131 and Enterococcus faecium ST17 in coastal marine sediments from an Italian beach

Fecal indicator bacteria (FIB) are used worldwide to assess water quality in coastal environments, but little is known about their genetic diversity and pathogenicity. This study examines the prevalence, antimicrobial resistance, virulence, and genetic diversity of FIB isolated from marine sediments from a central Adriatic seaside resort. FIB, recovered from 6 out of 7 sites, were significantly more abundant at sampling stations 300 m offshore than close to the shore. Escherichia coli accounted for 34.5% of fecal coliforms, and Enterococcus faecalis accounted for 32% of enterococci. Most isolates (27% of E. coli and 22% of enterococci) were recovered from the sediments that had the highest organic content. Multidrug-resistant E. coli (31%) and enterococci (22%) were found at nearly all sites, whereas 34.5% of E. coli and 28% of enterococci harboring multiple virulence factors were recovered from just two sites. Pulsed-field gel electrophoresis typing showed wide genetic diversity among isolates. Human epidemic clones ( E. coli ST131 and Enterococcus faecium ST17) were identified for the first time by multilocus sequence typing in an area where bathing had not been prohibited. These clones were from sites far removed from riverine inputs, suggesting a wide diffusion of pathogenic FIB in the coastal environment and a high public health risk