Histone inhibitor as a putative radiosensitizer in pediatric glioblastoma cell lines

O glioblastoma (GBM) é considerado um dos tumores mais agressivos do sistema nervoso central (SNC). Mesmo com o uso de protocolos modernos de tratamento o prognóstico se mantém bastante reservado, sendo que crianças com GBM apresentam uma sobrevida média de 12 a 15 meses. Mecanismos epigenéticos podem interferir no processo de carcinogênese, sendo que a acetilação do DNA pode modular a expressão de genes que atuam no controle do ciclo celular, contribuindo assim para o desenvolvimento e progressão de neoplasias. Estudos clínicos demonstram que inibidores de histonas deacetilases (HDACs), em monoterapia ou combinados a outros agentes antineoplásicos, são clinicamente ativos e bem tolerados no tratamento de uma ampla variedade de tumores. Estes inibidores podem sensibilizar a resposta celular à irradiação ionizante, possibilitando uma redução nas doses-padrão utilizadas, minimizando os efeitos colaterais a curto e longo prazo. A radiação ionizante induz dano no DNA e é geralmente aceito que quebras da dupla-fita (DSBs) é o tipo de lesão mais severa relacionada à sobrevivência celular e preservação da integridade genômica. No presente estudo, avaliamos o potencial efeito radiosensibilizante do PCI-24781, um novo e potente pan-inibidor de HDAC nas linhagens celulares de GBM pediátrico SF188 e KNS42. Foram comparadas as taxas de proliferação celular, clonogenicidade e apoptose das linhagens SF188 e KNS42 com ou sem tratamento com PCI-24781. Também foram comparadas as taxas de clonogenicidade das linhagens SF188 e KNS42 que foram irradiadas com ou sem tratamento prévio com PCI-24781. Adicionalmente, foram avaliados os efeitos do PCI-24781 na expressão de algumas das principais proteínas responsáveis pelo reparo de quebras da dupla-fita ocasionadas pela irradiação. Para os ensaios de proliferação celular foram utilizados os tempo de 24, 48, 72 e 96h, para apoptose, 48h e para capacidade clonogênica sem irradiação o tempo de 48h, em diferentes doses de PCI-24781 (0,25 - 16 M). O inibidor bloqueou significativamente a proliferação celular (p<0,05), induziu morte por apoptose (p<0,05) e reduziu a capacidade na formação de colônias (p<0,001) em ambas as linhagens. No ensaio para avaliação da radiosensibilidade, foram utilizadas as doses do IC30 11 de cada linhagem do ensaio clonogênico seguida de diferentes doses de irradiação. Ambas as linhagens apresentaram uma significativa (p<0,001) diminuição na formação de colônias em todas as doses de irradiação. A linhagem mais resistente à droga, SF188 foi escolhida para estudo do reparo de quebras da dupla-fita ocasionadas pela irradiação. As expressões da proteína Rad51, importante na via de reparo por recombinação homóloga (HR), e das proteínas DNA-PKcs, Ku70 e Ku86, importantes na via de reparo por união terminal não-homóloga (NHEJ) apresentaram uma maior diminuição quando a linhagem irradiada foi previamente tratada com PCI-24781 em comparação à radioterapia exclusiva. Estes achados demonstram que o inibidor de histona PCI-24781 apresenta um importante papel como agente radiosensibilizante, comprometendo o reparo das quebras de dupla-fita em células de GBM pediátrico tratadas com radioterapia.Glioblastoma (GBM) is considered one of the most aggressive tumors to affect the central nervous system (CNS). Even employing modern treatment protocols the prognosis remains very poor, with children affected by GBM presenting a median survival rate of 12 to 15 months. Epigenetic mechanisms may interfere with the process of tumorigenesis, and DNA acetylation can modulate the expression of genes that contribute in cell cycle control and participate to the development and progression of cancer. Clinical studies demonstrate that histone deacetylase inhibitors (HDACs), alone or in combination with other antineoplastic agents, are clinically active and well tolerated in the treatment of a wide variety of tumors. These inhibitors may sensitize the cellular response to ionizing radiation, enabling the reduction in standard doses of radiation, ultimately minimizing both short and long-term side effects. Ionizing radiation induces DNA damage and it is generally accepted that the double-stranded breaks (DSBs) is the most severe type of injury related to cell survival and preservation of genomic integrity. In the present study, we evaluated the potential radiosensitizer effect of PCI-24781, a novel potent pan-HDAC inhibitor in the pediatric GBM cell lines SF188 and KNS42. We compared the cell proliferation rates, apoptosis of clonogenicity of KNS42 and SF188, with or without treatment with PCI-24781. Moreover, clonogenicity rates were compared between cell lines that were irradiated with or without prior treatment with PCI-24781 Additionally, we evaluated the effects of PCI-24781 in the expression of some of the major proteins responsible for the repair of double-stranded breaks caused by the irradiation. For the cell proliferation assays, the times of 24, 48, 72 and 96 hours were used, for apoptosis, the time of 48h and clonogenic capacity without irradiation, the time of 48h, and different doses of PCI-24781 (0,25 - 16 M). The inhibitor significantly blocked cell proliferation (p<0,05), inducing cell death by apoptosis (p<0,05) and reducing the colony forming ability (p<0,001) of both lineages. In the assays to evaluate the radiosensitivity , the IC30 doses of the clonogenic assays were used for each cell-line after different doses of irradiation. Both lineages showed a significant decrease (p<0,001) in colony formation at all doses of irradiation. The most resistant cell-line to the drug, SF188, was 13 chosen to study the double-strand breaks repair caused by irradiation. The Rad51 protein levels, critical for homologous recombination (HR), and the DNA-PKcs proteins Ku70 and Ku86, important for DNA repair through non-homologous end joining (NHEJ) showed significant decrease in expression when cell-line was treated with PCI-24781 prior to radiotherapy. These data demonstrates that the histone deacetylase inhibitor PCI-24781 plays an important role as a radiosensitizer agent, compromising the repair of double-strand breaks in pediatric GBM cells following irradiation