A Functional Single-Nucleotide Polymorphism Upstream of the Collagen Type III Gene Is Associated with Catastrophic Fracture Risk in Thoroughbred Horses

Fractures caused by bone overloading are a leading cause of euthanasia in Thoroughbred racehorses. The risk of fatal fracture has been shown to be influenced by both environmental and genetic factors but, to date, no specific genetic mechanisms underpinning fractures have been identified. In this study, we utilised a genome-wide polygenic risk score to establish an in vitro cell system to study bone gene regulation in horses at high and low genetic risk of fracture. Candidate gene expression analysis revealed differential expression of COL3A1 and STAT1 genes in osteoblasts derived from high- and low-risk horses. Whole-genome sequencing of two fracture cases and two control horses revealed a single-nucleotide polymorphism (SNP) upstream of COL3A1 that was confirmed in a larger cohort to be significantly associated with fractures. Bioinformatics tools predicted that this SNP may impact the binding of the transcription factor SOX11. Gene modulation demonstrated SOX11 is upstream of COL3A1, and the region binds to nuclear proteins. Furthermore, luciferase assays demonstrated that the region containing the SNP has promoter activity. However, the specific effect of the SNP depends on the broader genetic background of the cells and suggests other factors may also be involved in regulating COL3A1 expression. In conclusion, we have identified a novel SNP that is significantly associated with fracture risk and provide new insights into the regulation of the COL3A1 gene

Establishing a safe harbor site for the introduction of genetic information in the human cells by the recombination system attP/attB

[eng] The goal of this project is to generate a safe harbor site in the genome of human cells, where information could be specifically inserted without the action of nucleases. The mechanism that we present here is based on two different sitespecific recombinases phiC31 and Bxb1, as well as on the piggyBack and Sleeping Beauty transposons. Recombinase phiC31 is an integrase used by phages to establish the lysogenic life cycle. During integration, phiC31 drives recombination between the attP and the attB attachment sites on the phage and host genome, respectively. In naturally occurring phage infestations, the end result is an integrated phage genome flanked by new attL and attR sites, generated by recombination of the original, attP and attB sites. In our system, the phage genome is substituted by the acceptor sites that will constitute the core of the safe harbor locus. Under inducing conditions, the phage genome is excised via integrase-mediated recombination between attL and attR regenerating the attP and attB attachment sites. This action is directed by PhiC31 in the presence of an accessory protein (the recombination directionality factor, RDF). The alternative use of phiC31, alone or together with RDF, allows for the indefinite repetition of the cycle and the subsequent incorporation into the targeted locus of as many attachment sites as needed. The whole mechanism is made possible by the coordinated and alternative use of piggyBac and Sleeping Beauty transposons that, at each step, remove residual DNA fragments (plasmid sequences, selection elements, etc.). Once the final configuration of the safe harbor locus is reached, the Bxb1 recombinase is used to upload the desired genetic information: markers, therapeutic genes, inducible system or even complete regulatory routes.[spa] El objetivo principal de este proyecto es generar una plataforma de carga segura dentro del genoma de células humanas, donde la información pueda ser insertada de forma específica sin la necesidad de usar nucleasas. De este modo se reduciría la posibilidad de integraciones azarosas y se aumentaría la eficiencia de integración. Para este fin, el mecanismo propuesto en la presente Tesis Doctoral combina el uso de dos recombinasas diferentes, phiC31 y Bxb1, así como de los sistemas de transposición piggyBac y Sleeping Beauty. La recombinasa phiC31 es una integrasa encargada de la incorporación del ADN de fagos en el hospedador durante el ciclo lisogénico. La integración se realiza mediante recombinación entre dos sitios de unión específicos, attP presente en el fago y attB localizado en el genoma del hospedador. Durante el proceso de infección el genoma del fago queda integrado en el genoma del hospedador y flanqueado por dos nuevos sitios de reconocimiento específico, attL y attR, generados a partir de la recombinación de las secuencias originales, attP y attB. En nuestro sistema, el genoma del fago es sustituido por los sitios de carga que constituirán el núcleo de la plataforma de integración. Bajo condiciones de inducción el genoma del fago puede eliminarse del sitio de integración mediante recombinación entre los sitios attL y attR, regenerándose en el proceso los sitios attB y attP originales. Esta reacción inversa la cataliza phiC31 en presencia de una proteína accesoria denominada Factor de Direccionalidad de la Recombinación (RDF, por sus siglas en inglés). El uso alternativo de phiC31 sola o en combinación con RDF, hace posible la repetición indefinida del ciclo de carga y la consiguiente incorporación al locus genómico elegido de tantos sitios de recombinación como se consideren necesarios. El ensamblaje completo de la plataforma se consigue mediante el uso coordinado y alternativo de los transposones piggyBac y Sleeping Beauty que permite en cada paso la eliminación de los fragmentos de ADN no deseados (secuencias del plásmido, elementos de selección, etc.). Una vez constituida la plataforma de carga, la recombinasa Bxb1 es la responsable de mediar la carga de la información genética deseada: marcadores, genes terapéuticos, sistema inducible o incluso rutas regulatorias completas.[cat] L’objectiu principal d’aquest projecte és generar una plataforma de càrrega segura dins el genoma, en cèl·lules humanes, on la informació pugui ser inserida de manera específica i sense necessitat d’usar nucleases. D’aquesta manera es reduiria la possibilitat d’integracions degudes a l’atzar i s’augmentaria l’eficiència d’integració. Amb aquest finalitat, el mecanisme proposat en la present Tesi doctoral combina l’ús de dues recombinases diferents, phiC31 i Bxb1, així com dels transposons piggyBac i Sleeping Beauty. La recombinasa phiC31 és una integrasa encarregada de la incorporació de l’ADN de fags a l’hoste durant el cicle lisogènic. Aquesta integració es realitza mitjançant la recombinació entre dos llocs d’unió específics, attP present en el fag i attB localitzat en el genoma de l’hoste. Durant el procés d’infecció el genoma del fag queda integrat en el genoma de l’hoste i flanquejat per dos llocs de reconeixement específic nous, attL i attR, generats a partir de la recombinació de les seqüències originals, attP i attB. En el nostre sistema, el genoma del fag és substituït pels llocs de càrrega que constituiran el nucli de la plataforma d'integració. Sota condicions d'inducció el genoma del fag pot eliminar del lloc d'integració mitjançant recombinació entre els llocs attL i attr, regenerant-se en el procés els llocs attB i attP originals. Aquesta reacció inversa la catalitza phiC31 en presència d'una proteïna accessòria anomenada Factor de Direccionalitat de la Recombinació (RDF, per les sigles en anglès). L'ús alternatiu de phiC31 sola o en combinació amb RDF, fa possible la repetició indefinida del cicle de càrrega i la consegüent incorporació al locus genòmic triat de tants llocs de recombinació com es considerin necessaris. L'acoblament complet de la plataforma s'aconsegueix mitjançant l'ús coordinat i alternatiu dels transposons piggyBac i Sleeping Beauty que permet a cada pas l'eliminació dels fragments d'ADN no desitjats (seqüències del plàsmid, elements de selecció, etc.). Un cop constituïda la plataforma de càrrega, la recombinasa Bxb1 és emprada per a la càrrega d'informació genètica desitjada: marcadors, gens terapèutics, sistemes induïble o inclús rutes reguladores completes