Exploring the role of CDNF and MANF removal in the brain and in the unfolded protein response

Protein homeostasis is essential for the whole cell function. Therefore, cells monitor protein synthesis, folding, and degradation closely. Disturbances in secretory and membrane protein folding can cause accumulation of misfolded and unfolded proteins in the endoplasmic reticulum (ER). This condition, called ER stress, can predispose for manifestation of various diseases including neurodegenerative diseases such as Parkinson’s disease. Cells activate the unfolded protein response (UPR) to alleviate ER stress and restore homeostasis. Members of a novel neurotrophic factor family, cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF) and mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF), are components of the UPR machinery. They are small proteins widely expressed in mammalian tissues and mostly localized to the ER lumen. CDNF and MANF can reduce ER stress with a mechanism that is not fully understood. In addition, they also promote survival of neuronal and non-neuronal cells in different animal disease models. In animal models of Parkinson’s disease, they both protect and even restore the function of midbrain dopamine neurons. However, the involvement of endogenous CDNF and MANF in the maintenance and regulation of dopamine neurons in mice is not known. The aim of this thesis was to examine the role of endogenous CDNF and MANF deletion in UPR regulation in vivo. We also aimed to investigate the role of their deficiency in the maintenance and function of midbrain dopamine neurons as knockdown of MANF results in changes in the dopamine system in fruit fly and zebrafish. In this thesis, we characterized CDNF and MANF knockout mice and analyzed their UPR gene expression and the midbrain dopamine system by gene expression analyses, immunohistochemical methods, and behavioral tests. Compensation between CDNF and MANF was investigated in the third study where we developed and characterized mice lacking both CDNF and MANF. This study demonstrates that MANF ablation causes an increase in UPR gene expression in the developing, adult, and aged brain in vivo and in cortical neurons in vitro. In particular, the inositol-requiring enzyme 1 α (IRE1α) pathway of UPR is persistently activated in the MANF-deficient brain. CDNF ablation, instead, induces UPR gene upregulation in the skeletal muscle, which is aggravated by MANF ablation. This indicates that MANF can functionally compensate for CDNF. We show that vice versa, CDNF cannot compensate for MANF function in the tissues studied. Furthermore, this thesis addresses the role of CDNF and MANF in the function and maintenance of the midbrain dopamine system. We investigated the integrity of dopamine fibers and dopamine neurons in aged mice lacking CDNF, MANF, or both. Furthermore, motor behavior of these mice was investigated to measure the function of the dopamine system. Our data indicated that these mice did not show degeneration of the midbrain dopamine system upon aging although CDNF-deficient mice display functional changes in dopamine neurons. In conclusion, this thesis work elucidates the importance of CDNF and MANF in regulating the UPR with tissue specificity in vivo. In addition, we provide data about the role of endogenous CDNF and MANF in the maturation and maintenance of the midbrain dopamine system.  Proteiinitasapaino on elintärkeää solujen toiminnalle. Tästä syystä solut seuraavat proteiinien tuotantoa, laskostumista ja hajotusta tarkasti. Häiriöt eritettävien tai kalvoproteiinien laskostumisessa voivat aiheuttaa väärin laskostuneiden tai laskostumattomien proteiinien kertymistä solulimakalvostoon (endoplasmic reticulum, ER). Tätä tilaa kutsutaan ER-stressiksi, joka voi altistaa useiden sairauksien puhkeamiselle. Etenkin hermorappeumasairauksissa, kuten Parkinsonin taudissa, ER-stressin on osoitettu olevan osa taudin syntyä. Solut käynnistävät ER-stressiä lievittääkseen reaktion nimeltä laskostumattomien proteiinien vaste (unfolded protein response, UPR). Uuden hermokasvutekijäperheen jäsenet – dopamiinihermokasvutekijä (CDNF) ja mesenkefaalinen astrosyyttiperäinen hermokasvutekijä (MANF) – ovat osa UPR-koneistoa. Ne ovat pieniä proteiineja, joita tuotetaan laajasti nisäkkäiden eri kudoksissa. Solussa ne sijaitsevat pääosin ER:n ontelossa. Sekä CDNF että MANF vähentävät ER-stressiä toistaiseksi tuntemattomalla tavalla. Tämän lisäksi ne suojelevat hermosoluja sekä muita soluja erilaisten tautien eläinmalleissa. Parkinsonin taudin eläinmalleissa ne suojaavat dopamiinihermosoluja ja pystyvät palauttamaan näiden hermosolujen toiminnan. Toistaiseksi ei tiedetä osallistuvatko endogeenisesti tuotetut CDNF ja MANF dopamiinisolujen ylläpitoon ja säätelyyn hiirillä. Tämän väitöskirjan tavoitteena oli tutkia endogeenisen CDNF:n ja MANF:n poiston vaikutusta UPR:n säätelyyn. Me myös tutkimme niiden puutteen vaikutusta keskiaivojen dopamiinisolujen selviytymiseen ja toimintaan, koska MANF:n puuttumisen on aiemmin osoitettu aiheuttavan muutoksia dopamiinisoluissa niin banaanikärpäsillä kuin seeprakaloilla. Tässä työssä analysoimme poistogeenisiä hiiriä, joilta on poistettu CDNF:n tai MANF:n ekspressio hiirten kehitysvaiheessa. Näiden hiirten avulla selvitimme CDNF: ja MANF:n poiston vaikutuksia analysoimalla muutoksia geenien ja proteiinien ekpressiossa, hyödyntämällä immunohistokemiallisia menetelmiä, sekä tutkimalla hiirten käytöstä. Kompensaatiota CDNF:n ja MANF:n välillä tutkittiin väitöskirjan kolmannessa osatutkimuksessa, jossa tuotettiin ja analysoitiin hiiriä, joilta puuttuu sekä CDNF että MANF. Tämä väitöskirjatutkimus osoittaa, että MANF:n poisto aiheuttaa UPR-geenien ekspression lisääntymistä niin kehittyvien, aikuisten, kuin ikääntyneiden hiirten aivoissa sekä kortikaalisissa hermosoluissa. UPR:n reiteistä erityisesti IRE1α-reitti (inositolia vaativa entsyymi 1 α) säilyy aktivoituna aivoissa, joista MANF puuttuu. CDNF:n poisto sen sijaan aktivoi UPR-geenien ekspressiota luustolihaksessa ja tämä aktivaatio voimistuu, kun MANF poistetaan myös. Tämä viittaa siihen, että MANF voi korvata CDNF-proteiinin toimintaa. Tämä ei kuitenkaan ole vastavuoroista, sillä CDNF ei näytä kompensoivan MANF-proteiinia tutkituissa kudoksissa. Lisäksi tämä työ havainnollistaa CDNF:n ja MANF:n roolia keskiaivojen dopamiinisolujen toiminnassa. Dopamiinisäikeiden ja dopamiinisolujen tilaa tutkittiin hiiriltä, joilta puuttui CDNF, MANF tai molemmat. Lisäksi motorista käytöstä tutkittiin selvittääksemme dopamiinisolujen toimintaa. Tulokset osoittivat, että näillä hiirillä ei ollut havaittavissa dopamiinisysteemin degeneraatiota ikääntymisen myötä vaikkakin CDNF-puutteisilla dopamiinisoluilla oli muutoksia toiminnassa. Johtopäätöksenä voimme sanoa, että tämä väitöskirjatyö havainnollistaa CDNF:n ja MANF:n tärkeää osaa UPR:n säätelyssä ja osoittaa, että niiden vaikutus UPR:n säätelyyn riippuu kudoksesta. Lisäksi päättelemme, että malliemme perusteella nämä proteiinit eivät ole välttämättömiä dopamiinisolujen kehitykselle tai selviytymiselle.

Comparative Linguistic Analysis of Professional and Non-professional Online Book Reviews

Tutkielmassani analysoin kirja-arvosteluita ja niissä esiintyvää arviointia. Tarkoituksena on näyttää, mistä osista internetissä julkaistavat kirja-arvostelut koostuvat eli minkälaiset piirteet ovat tyypillisiä kirja-arvosteluista koostuvalle genrelle sekä ammattikriitikoiden että harrastelijoiden keskuudessa. Tämän lisäksi vertailen ammattikriitikoiden ja harrastelijakriitikoiden kielen käyttöä. Tutkimuksen teoria perustuu genreanalyysiin, erityisesti Paltridgen (1995) esittämään analyysimalliin, ja kielessä esiintyvän evaluaation analyysi keskittyy kirja-arvosteluissa käytettävään vertailuun, subjektiivisuuteen sekä kirjoja arvottaviin ilmaisuihin (Thompson & Hunston: 2000). Tutkimuksen materiaali koostuu ammattikriitikoiden ja harrastelijakriitikoiden kirja-arvosteluista. Ammattikriitikoiden kirja-arvostelut kerättiin kahden sanomalehden The New York Timesin ja The Guardianin verkkosivuilta, kun taas Goodreads ja LibraryThing toimivat harrastelija kirja-arvosteluiden lähteinä. Yhteensä materiaali sisältää kaksitoista ammattikriitikoiden ja 48 harrastelijoiden kirja-arvostelua. Harrastelijoiden arvosteluja on käytettävässä materiaalissa enemmän, koska niiden välillä on enemmän eroja ja ne ovat lyhyempiä verrattuna ammattikriitikoiden kirja-arvosteluihin. Analyysin perusteella kirja-arvostelut muodostuvat kahdesta tärkeästä osasta. Ne sisältävät kirjaa kuvailevan osan, johon sisältyy esimerkiksi juonen ja kirjailijan esittely, ja kirjaa arvioivan osan, johon kuuluu esimerkiksi kirjoitustyylin tai hahmojen arvostelua. Tutkimuksen tulokset osoittavat myös, että ammattikriitikoiden ja harrastelija-arvostelujen väliltä löytyy niitä erottavia piirteitä. Osa harrastelijoiden kirja-arvosteluista ei sisällä kirjaa kuvailevia osia, vaan ne koostuvat ainoastaan kirjaa arvioivista osista. Ammattikriitikoiden kirja-arvosteluissa taas on enemmän kirjailijoita koskevaa informaatiota ja muutenkin enemmän kirjojen sisältöihin liittyvää tietoa. Ammattikriitikoiden arvosteluista löytyy myös enemmän vertailevaa kieltä harrastelijoihin verrattuna. Kirjojen positiivisia ja negatiivisia piirteitä tuodaan esiin esimerkiksi vertaamalla niitä toisiin teoksiin. Ammattiarvostelijoihin verrattuna, harrastelijat puolestaan ovat subjektiivisempia kirjoja arvioidessaan. He käyttivät esimerkiksi enemmän minä-pronominia kertoessaan, mitä he tunsivat kirjaa lukiessaan ja mitä he pitivät kirjasta

CDNF and MANF regulate ER stress in a tissue-specific manner

Cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF) and mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) display cytoprotective effects in animal models of neurodegenerative diseases. These endoplasmic reticulum (ER)-resident proteins belong to the same protein family and function as ER stress regulators. The relationship between CDNF and MANF function, as well as their capability for functional compensation, is unknown. We aimed to investigate these questions by generating mice lacking both CDNF and MANF. Results showed that CDNF-deficient Manf(-/-) mice presented the same phenotypes of growth defect and diabetes as Manf(-/-) mice. In the muscle, CDNF deficiency resulted in increased activation of unfolded protein response (UPR), which was aggravated when MANF was ablated. In the brain, the combined loss of CDNF and MANF did not exacerbate UPR activation caused by the loss of MANF alone. Consequently, CDNF and MANF deficiency in the brain did not cause degeneration of dopamine neurons. In conclusion, CDNF and MANF present functional redundancy in the muscle, but not in the other tissues examined here. Thus, they regulate the UPR in a tissue-specific manner.Peer reviewe

CDNF and MANF in the brain dopamine system and their potential as treatment for Parkinson’s disease

Parkinson’s disease (PD) is a progressive neurodegenerative disease characterized by gradual loss of midbrain dopamine neurons, leading to impaired motor function. Preclinical studies have indicated cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF) and mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) to be potential therapeutic molecules for the treatment of PD. CDNF was proven to be safe and well tolerated when tested in Phase I-II clinical trials in PD patients. Neuroprotective and neurorestorative effects of CDNF and MANF were demonstrated in animal models of PD, where they promoted the survival of dopamine neurons and improved motor function. However, biological roles of endogenous CDNF and MANF proteins in the midbrain dopamine system have been less clear. In addition to extracellular trophic activities, CDNF/MANF proteins function intracellularly in the endoplasmic reticulum (ER), where they modulate protein homeostasis and protect cells against ER stress by regulating the unfolded protein response (UPR). Here, our aim is to give an overview of the biology of endogenous CDNF and MANF in the brain dopamine system. We will discuss recent studies on CDNF and MANF knockout animal models, and effects of CDNF and MANF in preclinical models of PD. To elucidate possible roles of CDNF and MANF in human biology, we will review CDNF and MANF tissue expression patterns and regulation of CDNF/MANF levels in human diseases. Finally, we will discuss novel findings related to the molecular mechanism of CDNF and MANF action in ER stress, UPR, and inflammation, all of which are mechanisms potentially involved in the pathophysiology of PD

Live-cell monitoring of protein localization to membrane rafts using protein-fragment complementation

The plasma membrane consists of a variety of discrete domains differing from the surrounding membrane in composition and properties. Selective partitioning of protein to these microdomains is essential for membrane functioning and integrity. Studying the nanoscale size and dynamic nature of the membrane microdomains requires advanced imaging approaches with a high spatiotemporal resolution and, consequently, expensive and specialized equipment, unavailable for most researchers and unsuited for large-scale studies. Thus, understanding of protein partitioning to the membrane microdomains in health and disease is still hampered by the lack of inexpensive live-cell approaches with an appropriate spatial resolution. Here, we have developed a novel approach based on Gaussia princeps luciferase protein-fragment complementation assay to quantitively investigate protein partitioning to cholesterol and sphingomyelin-rich domains, sometimes called 'lipid rafts', in intact living cells with a high-spatial resolution. In the assay, the reporter construct, carrying one half of the luciferase protein, is targeted to lipid microdomains through the fused acetylation motif from Src-family kinase Fyn. A protein of interest carries the second half of the luciferase protein. Together, this serves as a reversible real-time sensor of raft recruitment for the studied protein. We demonstrated that the assay can efficiently detect the dynamic alterations in raft localization of two disease-associated proteins: Akt and APP. Importantly, this method can be used in high-throughput screenings and other large-scale studies in living cells. This inexpensive, and easy to implement raft localization assay will benefit all researchers interested in protein partitioning in rafts.Peer reviewe

Mesencephalic Astrocyte-Derived Neurotrophic Factor (MANF) Is Highly Expressed in Mouse Tissues With Metabolic Function

Peer reviewe

MANF ablation causes prolonged activation of the UPR without neurodegeneration in the mouse midbrain dopamine system

Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) is an endoplasmic reticulum (ER) localized protein that regulates ER homeostasis and unfolded protein response (UPR). The biology of endogenous MANF in the mammalian brain is unknown and therefore we studied the brain phenotype of MANF-deficient female and male mice at different ages focusing on the midbrain dopamine system and cortical neurons. We show that a lack of MANF from the brain led to the chronic activation of UPR by upregulation of the endoribonuclease activity of the inositol-requiring enzyme 1 alpha (IRE1 alpha) pathway. Furthermore, in the aged MANF-deficient mouse brain in addition the protein kinase-like ER kinase (PERK) and activating transcription factor 6 (ATF6) branches of the UPR pathways were activated. Neuronal loss in neurodegenerative diseases has been associated with chronic ER stress. In our mouse model, increased UPR activation did not lead to neuronal cell loss in the substantia nigra (SN), decrease of striatal dopamine or behavioral changes of MANF-deficient mice. However, cortical neurons lacking MANF were more vulnerable to chemical induction of additional ER stress in vitro. We conclude that embryonic neuronal deletion of MANF does not cause the loss of midbrain dopamine neurons in mice. However, endogenous MANF is needed for maintenance of neuronal ER homeostasis both in vivo and in vitro.Peer reviewe

CDNF Interacts with ER Chaperones and Requires UPR Sensors to Promote Neuronal Survival

Cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF) is a neurotrophic factor that has beneficial effects on dopamine neurons in both in vitro and in vivo models of Parkinson’s disease (PD). CDNF was recently tested in phase I-II clinical trials for the treatment of PD, but the mechanisms underlying its neuroprotective properties are still poorly understood, although studies have suggested its role in the regulation of endoplasmic reticulum (ER) homeostasis and the unfolded protein response (UPR). The aim of this study was to investigate the mechanism of action of CDNF through analyzing the involvement of UPR signaling in its anti-apoptotic function. We used tunicamycin to induce ER stress in mice in vivo and used cultured primary neurons and found that CDNF expression is regulated by ER stress in vivo and that the involvement of UPR pathways is important for the neuroprotective function of CDNF. Moreover, we used AP-MS and BiFC to perform the first interactome screening for CDNF and report novel binding partners of CDNF. These findings allowed us to hypothesize that CDNF protects neurons from ER-stress-inducing agents by modulating UPR signaling towards cell survival outcomes

GATA6 modulates the ductular reaction to bile duct ligation

Background GATA6, a transcription factor expressed in cholangiocytes, has been implicated in the response to liver injury. In biliary atresia, a disease characterized by extrahepatic bile duct obstruction, liver expression of GATA6 increases with pathological bile duct expansion and decreases after successful Kasai portoenterostomy. The aim of this study was to garner genetic evidence that GATA6 is involved in ductular formation/expansion. Methods The murine Gata6 gene was conditionally deleted using Alb-cre, a transgene expressed in hepatoblasts (the precursors of hepatocytes and cholangiocytes) and mature hepatocytes. Bile duct ligation (BDL) was used to model biliary obstruction. Results Alb-Cre;Gata6(flox/flox) mice were viable and fertile. Cre-mediated recombination of Gata6 in hepatocytes had little impact on cellular structure or function. GATA6 immunoreactivity was retained in a majority of biliary epithelial cells in adult Alb-Cre;Gata6(flox/flox) mice, implying that surviving cholangiocytes were derived from hepatoblasts that had escaped biallelic Cre-mediated recombination. Although GATA6 immunoreactivity was preserved in cholangiocytes, Alb-cre;Gata6(flox/flox) mice had a demonstrable biliary phenotype. A neutrophil-rich infiltrate surrounded newly formed bile ducts in neonatal Alb-Cre;Gata6(flox/flox) mice. Foci of fibrosis/necrosis, presumed to reflect patchy defects in bile duct formation, were observed in the livers of 37% of adult Alb-cre;Gata6(flox/flox) mice and 0% of controls (p <0.05). Most notably, Alb-cre;Gata6(flox/flox) mice had an altered response to BDL manifest as reduced survival, impaired bile ductule proliferation, increased parenchymal necrosis, reduced fibrosis, and enhanced macrophage accumulation in the portal space. Conclusions GATA6 orchestrates intrahepatic biliary remodeling and mitigates liver injury following extrahepatic bile duct obstruction. Graphic abstractPeer reviewe