ОЦІНКА ПОКАЗНИКІВ ЛАТЕНТНОГО ПЕРІОДУ БУЛЬБОКАВЕРНОЗНОГО РЕФЛЕКСУ ТА ЕЛЕКТРОМІОГРАФІЇ В ДІАГНОСТИЦІ ТА ЛІКУВАННІ ХВОРИХ ІЗ ПІДВИЩЕНИМ ТОНУСОМ НЕРВОВО-М’ЯЗОВИХ СТРУКТУР СЕЧОВОГО МІХУРА ТА ДИСТАЛЬНИХ ВІДДІЛІВ ТОВСТОЇ КИШКИ ЗА ГІПЕРКІНЕТИЧНИМ ТИПОМ

Purpose: improving the effectiveness of diagnosis and treatment of patients with increased tonus of neuromuscular structures of the bladder and distal colonies of the hyperkinetic type.Materials and Methods. The study group included 33 individuals with a combined neurogenic pathology of the lower sections of the urinary system and the lower sections of the colon. Diagnosis of functional disorders of the bladder and colon was performed with the definition of the latent period of bulbo-cavernous reflex under the control of electromyography.Results. The conducted studies allowed the evaluating the indicators of the latent period of bulbocavernous reflux and electromyography in the diagnosis of patients with increased tonus of the neuromuscular structures of the bladder and of the distal colonies of the hyperkinetic type. Data of electromyographic studies allowed the developing and optimize treatment methods depending on the tone of the neuromuscular structures of the lower urinary tract and distal colon.Conclusion. Conductive conservative treatment of patients with increased tonus of the neuromuscular structures of the bladder and distal gastrointestinal segments of the hyperkinetic type by electrostimulation of the braking technique is effective, providing a positive effect in 91.4 % of cases.Мета: підвищити ефективність діагностики та лікування хворих із підвищеним тонусом нервово-м’язових структур сечового міхура та дистальних відділів товстої кишки за гіперкінетичним типом.Матеріали і методи. В групу дослідження увійшло 33 особи з поєднаною нейрогенною патологією нижніх відділів сечовивідної системи і нижніх відділів товстої кишки. Діагностику функціональних порушень сечового міхура та товстої кишки проводили з визначенням латентного періоду бульбокавернозного рефлексу під контролем електроміографії.Результати. Проведені дослідження дозволили оцінити показники латентного періоду бульбокавернозного рефлексу і електроміографії в діагностиці хворих із підвищеним тонусом нервово-м’язових структур сечового міхура і дистальних відділів товстої кишки за гіперкінетичним типом. Дані електроміографічних досліджень дозволили розробити і оптимізувати методи лікування залежно від тонусу нервово-м’язових структур нижніх сечових шляхів і дистальних відділів товстої кишки.Висновок. Проведене консервативне лікування пацієнтів із підвищеним тонусом нервово-м’язових структур сечового міхура і дистальних відділів товстої кишки за гіперкінетичним типом шляхом електростимуляції за гальмівною методикою є ефективним, забезпечує позитивний ефект в 91,4 % випадків

БИОСТАБИЛЬНОСТЬ И ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ НА ОСНОВЕ СШИТЫХ БИОПОЛИМЕРОВ

The increase in biostability of medical products/materials based on proteins and their derivatives, including resorbable 2Dand 3D-matrices for tissue engineering and regenerative medicine is usually achieved by means of cross-linking with glutaraldehyde (GA). One of the serious fl aws of the products stabilized with GA is their cytotoxicity caused by trace amounts of GA which are diffi cult to remove from cross-linked biopolymer matrices, thus the search for chemical and physical methods of cross-linking of such medical products remains essential. Aim: to compare the infl uence of various cross-linking methods on the cytotoxicity of collagen and gelatin samples.Materials and methods. Samples – fi lms with diameter of 30 mm and thickness of ~ 150 μm, – were obtained by irrigation method usingthesolution of scleral collagen (SC) of Type farm animals or with gelatin with the subsequent drying at 37º С until constant weight on air. Samples of porous matrices in shape of tubes of gelatin and polyoxybutirate-co-valerate with the weight ratio 2:1 were obtained by electrospinning. The cytotoxicity of structurally stabilized samples was studied by fi ve methods: 1) dehydrothermal cross-linking with the residual pressure of 10–20 mm Hg and temperature of 120 °С; 2) injection of GA immediately into the biopolymer solution; 3) with GA vapors; 4) with GA vapors with the subsequent incubation in phosphate buffered saline (PBS) with рН = 7.4; 37 °С; 24 h; 5) with GA vapors with the subsequent incubation in 0.1% lysine solution with рН = 7.4; 37 °С; 24 hour in DMEM medium. Cytotoxicity of samples was evaluated according to the requirements of interstate standard GOST ISO 10993-5-2011 on the culture of mice fi broblasts of NIH 3Т3 line using extracts from samples (37 °С; 24 h) and by means of direct contact of samples with these cells.Results. Matrices treated hydrothermally demonstrated complete absence of cytotoxicity. Samples, fi xated in GA solution in the range of concentrations from 0.01 to 1.0% demonstrated a high level of cytotoxicity which does not answer the requirements of GOST ISO 10993-5-2011. Fixation of collagen and gelatin matrices with GA vapors during 48 h infl uences their cytotoxicity minimally but with the treatment time increased to 72 hours cytotoxicity escalates to severe levels. With the subsequent incubation of cytotoxic gelatin samples in PBS the decrease in cytotoxicity to the levels corresponding with the requirements of GOST ISO 10993-5-2011 was observed. For the analogous decrease in cytotoxicity of collagen fi lms treated with GA vapors during more than 48 h an additional incubation in lysine solution was needed.Conclusion. Dehydrothermal cross-linking method is optimal from the view point of absence of cytotoxicity of stabilized biopolymers, however its area of application is limited by the risk of infl uence of high temperatures on the medico-technical properties of the products. Fixation in GA vapors is a universally applicable and a rather simple method of treatment of medical products or biopolymer-based coatings, but it does not resolve the issue of their cytotoxicity at treatment times exceeding 48 h. Rinsing in buffer solution in case of gelatin or treatment with the amino acid (lysine) solution in case of collagen allow to decrease the level of cytotoxicity of products stabilized with GA vapors to the values corresponding with the requirements of GOST ISO 10993-5-2011.Увеличение биостабильности медицинских изделий/материалов на основе белков и их производных, в том числе резорбируемых 2Dи 3D-матриксов для тканевой инженерии и регенеративной медицины, достигается в основном сшивкой глутаровым альдегидом (ГА). Одним из серьезных недостатков стабилизированных ГА изделий является их цитотоксичность, обусловленная следовыми количествами ГА, трудно удаляемых из сшитых биополимерных матриксов, поэтому поиск химических и физических способов сшивки таких медицинских изделий остается актуальной задачей.Цель: сравнить влияние различных методов сшивки на цитотоксичность образцов из коллагена и желатина.Материалы и методы. Образцы в виде пленок диаметром 30 мм и толщиной ~150 мкм получали методом полива из раствора склерального коллагена (СК) сельскохозяйственных животных I типа или желатина с последующей сушкой при 37 °С до постоянного веса на воздухе. Образцы пористых матриксов в виде трубок из смеси желатина и полиоксибутирата-ко-валерата в соотношении 2 : 1 по весу получали методом электроспиннинга. Исследовали цитотоксичность образцов, структурно стабилизированных пятью способами: 1) дегидротермосшивкой при остаточном давлении 10–20 мм рт. ст. и температуре 120 °С; 2) введением ГА непосредственно в раствор биополимера; 3) парами ГА; 4) парами ГА с последующей инкубацией в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) при рН = 7,4; 37 °С; 24 ч; 5) парами ГА с последующей инкубацией в 0,1% растворе лизина при рН = 7,4; 37 °C; 24 ч или в среде DMEM. Цитотоксичность образцов оценивали согласно требованиям межгосударственного стандарта ГОСТ ISO 10993-5-2011 на культуре фибробластов мыши линии NIH 3Т3 с использованием экстрактов из образцов (37 °С; 24 ч) и методом прямого контакта образцов с этими клетками.Результаты. Дегидротермообработанные матриксы показали полное отсутствие цитотоксичности. Образцы, фиксированные в растворе ГА в интервале концентраций от 0,01 до 1,0%, проявляли высокий уровень цитотоксичности, не удовлетворяющий требованиям ГОСТ ISO 10993-5-2011. Фиксация коллагеновых и желатиновых матриксов парами ГА в течение 48 ч оказывает минимальное влияние на их цитотоксичность, но с увеличением времени обработки до 72 часов цитотоксичность возрастает до уровня «резкая». При последующей инкубации цитотоксичных образцов из желатина в ФСБ наблюдали снижение цитотоксичности до уровня, удовлетворяющего требованиям ГОСТ ISO 10993-5-2011. Для аналогичного снижения цитотоксичности пленок из коллагена, обработанных парами ГА в течение более 48 ч, требовалась дополнительная инкубация в растворе лизина.Заключение. Метод дегидротермосшивки является оптимальным с точки зрения отсутствия цитотоксичности стабилизированных биополимеров, однако область его применения ограничена риском воздействия высоких температур на медико-технические свойства изделий. Фиксация в парах ГА является универсальным и достаточно простым способом обработки медицинских изделий или покрытий на основе биополимеров, но не решает вопрос их цитотоксичности при временах обработки, превышающих 48 ч. Снизить степень цитотоксичности изделий, стабилизированных парами ГА, до значений, удовлетворяющих требованиям ГОСТ ISO 10993-5-2011, позволяет отмывка в буферном растворе в случае желатина или обработка раствором аминокислоты (лизина) в случае коллагена

Криогенно-структурированный гидрогель на основе желатина как резорбируемая макропористая матрица для биомедицинских технологий

Objective: to investigate the biological properties of a matrix made of cryogenically structured hydrogel in the form of a macroporous gelatin sponge, as well as the possibility of creating cell-engineered constructs (CECs) on its basis. Materials and methods. The main components of the cryogenically structured hydrogel were gelatin (type A) obtained from porcine skin collagen, N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide, (EDC) and urea (all from Sigma-Aldrich, USA). Surface morphology was examined using scanning electron microscopy (SEM). The degree of swelling in water of the samples was determined by gravimetric method. Cytotoxicity was studied on NIH3T3, a fibroblast cell line isolated from a mouse, and on human adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells (hAMSCs) using IncuCyte ZOOM (EssenBioscience, USA). The metabolic activity of hAMSCs was assessed using PrestoBlue™ reagents (Invitrogen™, USA). To create CECs, we used hAMSCs, human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 or human umbilical vein endothelial cell lines EA.hy926. Albumin content in the culture medium was determined by enzyme immunoassay. Ammonia metabolism rate was assessed after 90 minutes of incubation with 1 mM ammonium chloride (Sigma-Aldrich, USA) diluted in a culture medium on day 15 of the experiment. Results. Obtaining a cryogenically structured hydrogel scaffold in the form of macroporous gelatin sponge included freezing an aqueous solution of a gelatin+urea mixture, removal of polycrystals of frozen solvent by lyophilization, extraction of urea with ethanol and treatment of the cryostructurate with an ethanol solution of EDC. Scanning electron microscopy identified three types of pores on the carrier surface: large (109 ± 17 μm), medium (39 ± 10 μm), and small (16 ± 6 μm). The degree of swelling in water of the matrix samples was 3.8 ± 0.2 g H2O per 1 g of dry polymer. The macroporous gelatin sponge as a part of CEC was found to have the ability to support adhesion and proliferation of hAMSCs, EA.hy926 and HepG2 for 28, 15 and 9 days, respectively. Albumin secretion and ammonia metabolism when HepG2 cells were cultured on the gelatin sponge were detected. Conclusion. The use of a matrix made from macroporous cryogenically structured gelatin-based hydrogel for tissue engineering products is shown to be promising using a cell-engineered liver construct as a case.Цель: исследование биологических свойств матрицы из криогенно-структурированного гидрогеля в форме макропористой желатиновой губки, а также возможности создания на ее основе клеточно-инженерных конструкций. Материалы и методы. Основными компонентами криогенно-структурированного гидрогеля были желатин (тип А), полученный из коллагена свиной кожи, N-(3-диметиламинопропил)-N’-этил-карбодиимид, (ЭДК) и мочевина (все – Sigma-Aldrich, США). Морфологию поверхности исследовали с использованием сканирующей электронной микроскопии. Степень набухания в воде образцов определяли гравиметрическим методом. Цитотоксичность исследовали на фибробластах мыши линии NIH 3T3 и мезенхимальных стромальных клетках жировой ткани человека (МСК ЖТч) с использованием IncuCyte ZOOM (EssenBioscience, США). Метаболическую активность МСК ЖТч оценивали с помощью реагентов PrestoBlue™ (Invitrogen™, США). Для создания клеточно-инженерных конструкций (КИК) использовали МСК ЖТч, клетки гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 или эндотелиальные клетки пупочной вены человека линии EA.hy926. Содержание альбумина в культуральной среде определяли методом иммуноферментного анализа. Скорость метаболизма аммиака оценивали после 90 минут инкубации с 1 mM хлоридом аммония (Sigma-Aldrich, США), разведенным в культуральной среде на 15-е сутки эксперимента. Результаты. Получение матрицы из криогенно-структурированного гидрогеля в форме макропористой желатиновой губки включало замораживание водного раствора смеси желатина и мочевины, удаление поликристаллов замерзшего растворителя лиофилизацией, экстракцию мочевины этанолом и обработку криоструктурата этанольным раствором ЭДК. Сканирующая электронная микроскопия позволила выделить три типа пор на поверхности носителя: крупные (109 ± 17 мкм), средние (39 ± 10 мкм) и малые (16 ± 6 мкм). Степень набухания в воде образцов матрицы составила 3,8 ± 0,2 г Н2О на 1 г сухого полимера. Установлена способность макропористой желатиновой губки в составе КИК поддерживать адгезию и пролиферацию МСК ЖТч, эндотелиальных клеток пупочной вены человека линии EA.hy926 и HepG2 в течение 28, 15 и 9 суток соответственно. Доказано наличие секреции альбумина и метаболизма аммиака при культивировании клеток HepG2 на желатиновой губке. Заключение. На примере клеточно-инженерной конструкции печени показана перспективность использования матрицы из макропористого криогенно-структурированного гидрогеля на основе желатина для создания продуктов тканевой инженерии