Analyse comparative de la prévalence et de la diversité des communautés bactériennes des ensilages et du lait cru bovin

Le microbiote du lait cru est un déterminant majeur de sa qualité et de celle des produits dérivés. Dans les fermes laitières, l'hygiène et la santé du pis, les fèces, la litière et les fourrages conservés sont les principales sources de microorganismes qui contaminent l'environnement de l'étable et qui peuvent se retrouver dans le lait. Les ensilages de légumineuses et de graminées produits par fermentation lactique, outre les bactéries lactiques, sont riches en espèces microbiennes dont la prévalence, la diversité et l'abondance dépendent de facteurs incontrôlables tels que les paramètres environnementaux, et de facteurs contrôlables tels que les pratiques de gestion adoptées par les fermiers. Le choix du type de fourrages parmi lesquels le foin, les ensilages d'herbe/légume ou de maïs, l'utilisation ou non d'inoculants, le type d'inoculant commercial utilisé et les types de structures d'entreposage sont autant d'éléments qui influencent la composition microbienne des ensilages et dont la gestion a un impact peu documenté sur la qualité microbiologique du lait cru. Les travaux de cette thèse portent sur l'écologie microbienne des fourrages préservés et l'évaluation de leur contribution à la contamination du lait cru de vache. Pour ce faire, des méthodes de préservation d'échantillons de lait cru à base d'azidiol ou de bronopol ont été évaluées pour leur capacité à maintenir intactes la viabilité et l'abondance des communautés bactériennes présentes. Des échantillons de foin, d'ensilages inoculés et non inoculés, et de lait cru ont été prélevés deux fois, à l'automne 2015 et au printemps 2016 dans 24 fermes laitières au Québec. Les analyses métataxonomiques et des charges microbiennes déterminées par PCR quantitative après le traitement ou non des cellules microbiennes au propidium monoazide ont montré que l'azidiol combiné au diméthyle sulfoxide et une température de -20 °C permet de stabiliser le microbiote du lait cru pendant au moins 30 jours, et que l'azidiol seul maintient l'intégrité des communautés bactériennes pendant 10 jours à 4 °C. Ces études ont également démontré que le séquençage à haut-débit des régions V3-V4 et V6-V8 du gène codant pour l'ARN ribosomique 16S génère des données dont l'exploitation peut conduire à des conclusions plus ou moins divergentes selon les hypothèses de départ. L'importance d'un choix judicieux de la région hyper variable à séquencer est soulignée. Nos résultats ont révélé des différences entre le microbiote du foin et celui des ensilages, ainsi qu'entre les types d'ensilage inoculés et non inoculés. De plus, les rations alimentaires à base de foin, d'ensilage d'herbe/légume non inoculé, d'un mélange d'ensilage d'herbe/légume non inoculé et d'ensilage de maïs inoculé, ou d'un mélange d'ensilage d'herbe/légume et de maïs inoculés et non inoculés partagent jusqu'à 31 % de leur microbiote identifié au niveau de variants de séquences avec le lait cru produit dans les fermes correspondantes. Les taxons plausiblement transférés des fourrages au lait appartiennent surtout aux Proteobacteria, Firmicutes et Actinobacteria. Les résultats obtenus suggèrent que la contamination bactérienne du lait cru par les fourrages se fait de manière aléatoire. Il ressort de nos études que ces taxons supposément transférés des ensilages sont en grande partie responsables des différences observées entre les communautés bactériennes du lait des cinq types de rations. Bien que les structures phylogénétiques des échantillons de lait produits par les vaches alimentées avec les rations d'ensilages non inoculés ou inoculés se soient montrées significativement différentes, il est difficile de conclure sur l'impact réel des inoculants sur la qualité microbiologique du lait cru. L'analyse des réseaux de co-occurrence et de co-exclusion au sein du microbiote a révélé d'une part, dans les ensilages les interactions entre les bactéries lactiques et non-lactiques qui pourraient considérablement influencer le processus de fermentation et ultimement la qualité du produit final, et d'autre part, dans le lait des niches microbiennes associées aux sites de contamination du lait dans l'environnement à la ferme. Par l'implémentation des méthodes d'analyses multivariées et multi-table intégrant le microbiote et les paramètres physico-chimiques des matrices alimentaires échantillonnées, cette thèse propose une approche d'exploitation des données de métataxonomique permettant d'approfondir nos connaissances de la microbiologie du lait cru et des produits laitiers.The microbiota of raw bovine milk is tightly associated with its quality and that of derivatives. On dairy farms, udder health, faeces, beddings, and fermented forage are among the main sources of milk microbial contaminants. Grass/legume and corn silage obtained by lactic fermentation harbour complex microbial community of which the diversity, the prevalence, and abundance are driven by uncontrollable factors such as environmental conditions, or controllable factors inherent to farm management practices. Forage types including hay, grass/legume or corn silage, the use of microbial additives and their commercial types, and the types of storage structures may influence community assembly of mature silage. However, the impact of forage management practices on the raw milk microbiota is not fully understood. This thesis aimed at investigating the microbial ecology of preserved forage and assessing their contribution to the raw milk contamination. To do so, the ability of milk sample preservation methods based on azidiol or bronopol to maintain viable and stable microbiota over time was assessed. Forage and raw milk samples were collected twice from 24 dairy farms in Quebec, in the fall 2015 and the spring 2016. Analyses of metataxonomic and qPCR-based bacterial load data derived from cells treated or not with propidium monoazide to account for viability showed that azidiol combined with dimethyl sulfoxide prevented the microbiota instability of raw milk stored at -20 °C for at least 30 days. Azidiol used alone was additionally found to keep the microbiota in milk samples intact for up to 10 days when stored at 4 °C. It was demonstrated that for hypothesis-driven microbiota studies, divergent conclusions can be drawn from hight-throughput sequencing of the V3-V4 and V6-V8 hypervariable regions of the 16S rRNA gene pool. The importance of the hypervariable region to target is therefore highlighted. Our study revealed differences between hay microbiota and that of silage, whether inoculated or not. Moreover, forage ration combinations shared up to 31 % of their bacterial phylotypes with raw milk samples produced in the corresponding farms. Taxa that were probably transferred from forage ration combinations to raw milk encompassed the phyla Proteobacteria, Firmicutes, and Actinobacteria. Our results suggested that raw milk contamination on the farm occurs erratically, and that transferred taxa were mainly involved in differential abundance outcomes. Although the microbiota of milk samples associated with the five forage ration combinations exhibited differences in phylogenetic composition, concluding on the effects of microbial additives used for ensiling is a challenge. In this thesis, the analysis of bacteria interaction networks showed that co-occurrence or co-exclusion of lactic and non-lactic bacteria might considerably affect the microbiological quality of mature silage at feed-out. On the other hand, the same analysis performed with milk samples revealed microbial niches associated with milk contamination points on the farm environment. Through the implementation of multivariate multi-table analysis methods that integrated data from the microbiota and from the physicochemical characteristics of the sampled matrices, this thesis suggests methodological approaches that exploit metataxonomic data to deepen our knowledge of the raw milk microbiota and dairy products

Optimization of preservation methods allows deeper insights into changes of raw milk microbiota

The temporal instability of raw milk microbiota drastically affects the reliability of microbiome studies. However, little is known about the microbial integrity in preserved samples. Raw cow milk samples were preserved with azidiol or bronopol and stored at 4 ◦C, or with dimethyl sulfoxide (DMSO) or a mixture of azidiol and DMSO and stored at −20 ◦C for up to 30 days. Aliquots of 5-, 10-, and 30-day post-storage were treated with propidium monoazide (PMA), then analyzed by sequencing the 16S rRNA gene V3-V4 and V6-V8 regions. The V6-V8 gave a higher richness and lower diversity than the V3-V4 region. After 5-day storage at 4 ◦C, the microbiota of unpreserved samples was characterized by a drastic decrease in diversity, and a significant shift in community structure. The treatment with azidiol and DMSO conferred the best community stabilization in preserved raw milk. Interestingly, the azidiol treatment performed as well for up to 10 days, thus appearing as a suitable alternative. However, neither azidiol nor bronopol could minimize fungal proliferation as revealed by PMA-qPCR assays. This study demonstrates the preservative ability of a mixture of azidiol and DMSO and provides deeper insights into the microbial changes occurring during the cold storage of preserved raw milk

Prevalence and abundance of lactic acid bacteria in raw milk associated with forage types in dairy cow feeding

Lactic acid bacteria (LAB) found in milk can be responsible for organoleptic defects in cheese. In order to identify the source of LAB thatcouldpotentiallydevelop during cheesemaking, we evaluated theirprevalence and abundanceinmilk according to thetype of forage usedin dairy cow feeding. Foragesand bulk tank milk were sampled three times on 24farms using either hay alone (control), or grass or legume silagesupplemented or not with corn silage. Both types of silageswere either noninoculated, orinoculated with commercial preparations containing at least a Lactobacillus buchneristrainalong with Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium,or Pediococcus pentosaceus. Our resultsindicate that LAB viable counts in milksamples (2.56log cfu/mL) did not differaccording to the type of forage used. A total of 1239 LAB were isolated and identified by partial 16S rRNA gene sequencing. Although inoculation increased lactobacilli abundance in grass silage by 35%, we did not observe an effect on the LAB profile of milk. Indeed, there was no significant difference in milk LAB prevalence and abundanceaccording tothe type of forage(P >0.05). Moreover, isolates belonging to the L.buchnerigroup wererarely found in bulk tank milk (3/481isolates). Random amplified polymorphic DNA typing of 406LAB isolates revealed theplausibletransfer of some strains from silage to milk (~6%). Thus, forage is only a minor contributor to LAB contamination of milk