The p53 Family of Transcription Factors Represses the Alpha- fetoprotein Gene Expression in Hepatocellular Carcinoma

Background: p53 deletion and mutation as well as upregulation of alpha-fetoprotein (AFP) are hallmarks of hepatocarcinogenesis. p63 and p73 belong to the family of p53-related transcription factors expressing a variety of isoforms. The expression of dominant negative (ΔN) p73 is related to the reduced survival of patients with hepatocellular carcinoma (HCC). In this study, we characterized the interaction between p53 family-dependent signaling pathways and the regulation of AFP at the gene and protein levels as essential determinants of therapeutic response and prognosis in HCC. Methods: Putative p53-, p63- and p73-binding sites within the AFP gene were identified in silico. Hep3B cells were transfected with plasmids encoding for p53, p63 and p73 to analyze the interplay of the p53 family with AFP. AFP transcription was determined by RT-qPCR. Protein levels of AFP, p53, p63 and p73 were analyzed by Western blot. Results: Underlining the importance of the crosstalk between the p53 family-dependent pathways and AFP regulation we identified eight novel putative binding sites for the members of the p53 family within the introns 1, 2, 3, 4, 7, 8, 11, and 12 of the AFP gene. Accordingly, full-length isoforms of p53, p63 and p73 efficiently downregulated AFP both on mRNA and protein level. Thus, the p53 family members were identified to be major regulators of AFP repression. Of note, p63 was characterized as a novel and p73 as the most efficient repressor of AFP. Conclusion: p53 mutation and upregulation of AFP are essential oncogenic events in the development of HCC. Here we show that AFP gene regulation occurs via a combined action of the p53 family members p53, p63 and p73. All three tumor suppressors reduce AFP gene and protein expression. Thus, our findings reveal a novel interaction of p53 family-dependent signaling pathways and AFP regulation at the gene and protein levels in HCC

Charakterisierung der Regulation von AFP durch die p53-Familie im HCC

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist weltweit eine der häufigsten Tumorerkrankungen. Im Hinblick darauf, dass kurative Therapien wie die Lebertransplantation, die Resektion und lokal ablative Verfahren nur im Anfangsstadium des HCC und nur für eine bestimmte Gruppe von Patienten möglich sind, ist es wichtig, neue Therapieansätze zu entwickeln, welche die Heilungschance und die Überlebensrate für Patienten mit HCC verbessern. Der Fokus der vorliegenden Arbeit richtet sich auf das Alpha-Fetoprotein (AFP), das im gesunden Lebergewebe eines Erwachsenen nur in geringen Mengen exprimiert wird, dessen Expression aber im tumorösen Gewebe stark verstärkt wird. Neben der daraus abgeleiteten Funktion als Tumormarker für das HCC, wirkt AFP auch als tumorförderndes Antigen. So kann sich eine gesteigerte AFP-Menge auf die Funktion antigenpräsentierender Zellen und natürlicher Killerzellen negativ auswirken. Diese Schwächung der Immunantwort kann dann zur verstärkten Onkogenese und verstärktem Tumorwachstum führen. Ein wichtiger Repressor von AFP ist das p53-Protein, das aber in über der Hälfte aller Tumore mutiert oder deletiert ist. Dadurch ist eine p53-vermittelte Repression der AFP-Expression nicht mehr möglich und AFP kann in malignen Zellen hochreguliert werden. Wenig untersucht hingegen sind die p53-Familienmitglieder TAp63, TAp73 und ihre dominant negatigen Isoformen in Bezug auf die Regulation der AFP-Expression. Die genauen Zusammenhänge zwischen der p53-Familie und der AFP-Expression wurden daher in dieser Arbeit auf molekularer Ebene untersucht. Dazu wurden Hep3B-Zellen mit Plasmiden, die Gene der p53-Familie (p53, TAp63, TAp73, und ∆Np73) enthielten, transfiziert und analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Transfektion mit p53, TAp63 und TAp73 zu einer Abnahme der AFP-Menge führte. ∆Np73 zeigte keinen suppressiven Effekt auf die AFP Proteinmenge; im Gegenteil ∆Np73 führte zu einer Induktion von AFP. Dies unterstreicht die onkogenen Eigenschaften der ∆N-Formen der p53 Familie in der Regulation von AFP im HCC. Darüber hinaus ergab eine Bindungsstellenanalyse, dass in der Promotorregion und innerhalb der Intronabschnitte des AFP-Gens Bindungsstellen für p53, TAp63 und TAp73 vorliegen. Damit konnte durch diese Dissertation erstmals gezeigt werden, dass p63 ein hier erstmals beschriebener Repressor des AFP-Gens ist und somit die Funktion von p53 und TAp73 in der AFP-Regulation unterstützt ∆Np73 aktivierende Eigenschaften in Bezug auf die AFP-Transkription besitzt und sich somit antagonistisch zu p73 verhält, ∆Np73 aktivierend auf die AFP Expression wirkt, was wiederum die Onkogenität der trunkierten Isoformen der p53 Familie im HCC unterstreicht in Intron 1-4 des AFP-Gens Bindungsstellen für p53 Familienmitglieder lokalisiert sind sowohl der AFP-Promotor als auch Intron 1-4 des AFP-Gens Bindungsstellen für TAp63 aufweisen. Gerade im Hinblick auf AFP als onkogenes Protein werden durch diese Ergebnisse Grundlagen für die Entwicklung möglicher neuer Therapieoptionen für das HCC gelegt