Elucidando a resposta de resistência de Klebsiella pneumoniae ao peptídeo antimicrobiano PaDBS1R1 desde uma perspectiva proteômica

Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2019.A resistência aos antimicrobianos tem sido reconhecida como umas das maiores ameaças para a saúde humana no século XXI, sendo capaz de causar até 10 milhões de mortes anuais para o ano 2050. A resistência desenvolvida pelas bactérias Gram-negativas tem atingido níveis alarmantes, tornando-se ameaçadora a emergência de bactérias resistentes a múltiplos antibióticos incluindo os de último recurso. Klebsiella pneumoniae constitui uma das bactérias Gram-negativas mais resistente aos antibióticos, causando milhões de infecções anuais segundo estimativas. Portanto, novos antimicrobianos efetivos contra este tipo de bactérias são desejados. Nesse sentido, os peptídeos antimicrobianos (PAMs) têm sido indicados como antimicrobianos promissores. Recentemente, o peptídeo PaDBS1R1 foi descrito como um antimicrobiano potente contra bactérias Gram-negativas, incluindo K. pneumoniae resistente aos carbapenêmicos. No entanto, pouco conhecimento existe sobre o modo de ação desse peptídeo, assim como, sobre como as bactérias respondem ao desafio com o mesmo. Deste modo, o presente trabalho, apoiado nas vantagens oferecidas pelas abordagens proteômicas, pretende apontar novos elementos que permitam compreender com maior profundidade a interação K. pneumoniae-PaDBS1R1. Frente ao desafio com PaDBS1R1, a K. pneumoniae sensível ao peptídeo parece remodelar a maquinaria metabólica bacteriana, assim como vários mecanismos defensivos que incluem a produção de cápsula polissacarídea, a modificação de lipopolissacarídeos (LPS), bombas de efluxo e vias de dobramento de proteínas de membrana externa. Por outro lado, PaDBS1R1 parece induzir danos no DNA bacteriano via estresse oxidativo, enquanto a bactéria responde ativando sistemas de reparo do DNA. A exposição continua a concentrações sub-inibitórias do peptídeo parece favorecer a emergência de bactérias resistentes ao mesmo. Por outro lado, a K. pneumoniae resistente a PaDBS1R1, parece remodelar também a maquinaria metabólica, assim como múltiplos sistemas defensivos. Particularmente, os sistemas regulatórios PhoPQ, CpxRA e ZraPSR parecem coordenar a reposta anti-PaDBS1R1 via modificações dos LPS e bombas de efluxo. Um elemento distintivo foi o incremento significativo na abundância de proteínas associadas a sistemas anti-estresse oxidativo, sugerindo que uma resposta anti-estresse oxidativo robusta é essencial para a resistência a PaDBS1R1.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Antimicrobial resistance is recognized as one of the greatest threats to human health in the 21st century, which could cause up to 10 million of annual deaths by 2050. The resistance developed by Gram-negative bacteria has reached alarming levels, being threatening the emergence of bacteria resistant to multiple antibiotics including those of last resort. Klebsiella pneumoniae is one of the most antibiotic-resistant Gram-negative bacteria, causing millions of annual infections according to estimates. Therefore, effective antimicrobials against this type of bacteria are desired. In this regard, antimicrobial peptides (AMPs) have been pointed as promising antimicrobials. Recently, the peptide PaDBS1R1 has been described as a potent antimicrobial against Gram-negative bacteria, including carbapenem-resistant K. pneumoniae. However, little knowledge exists about the mode of action of this peptide, as well as how bacteria respond to the challenge with it. Thus, the present work, based on the advantages offered by the proteomic approaches, intends to bring new elements that allow a deeper understanding of the K. pneumoniae-PaDBS1R1 interplay. Our results suggest that when challenged with PaDBS1R1, the peptide-sensitive K. pneumoniae appears to reshape the bacterial metabolic machinery as well as various defensive mechanisms. These mechanisms included polysaccharide capsule production, lipopolysaccharide (LPS) modification, efflux pumps, and outer membrane protein folding pathways. On the other hand, PaDBS1R1 appears to induce bacterial DNA damage via oxidative stress, while the bacterium responds by activating DNA repair systems. Continuous exposure to sub-inhibitory concentrations of the peptide appear to facilitate the emergence of peptide-resistant bacteria. Moreover, PaDBS1R1-resistant K. pneumoniae also appears to reshape the metabolic machinery as well as multiple defensive systems. Specifically, the regulatory systems PhoPQ, CpxRA and ZraPSR appear to coordinate the anti-PaDBS1R1 response via LPS modifications and efflux pumps. A distinctive element of PaDBS1R1-resistant K. pneumoniae response was the significant increase in the protein abundances associated with anti-oxidative stress systems, suggesting that a robust anti-stress oxidative response it is essential for PaDBS1R1 resistance

Interference With Quorum-Sensing Signal Biosynthesis as a Promising Therapeutic Strategy Against Multidrug-Resistant Pathogens

Faced with the global health threat of increasing resistance to antibiotics, researchers are exploring interventions that target bacterial virulence factors. Quorum sensing is a particularly attractive target because several bacterial virulence factors are controlled by this mechanism. Furthermore, attacking the quorum-sensing signaling network is less likely to select for resistant strains than using conventional antibiotics. Strategies that focus on the inhibition of quorum-sensing signal production are especially attractive because the enzymes involved are expressed in bacterial cells but are not present in their mammalian counterparts. We review here various approaches that are being taken to interfere with quorum-sensing signal production via the inhibition of autoinducer-2 synthesis, PQS synthesis, peptide autoinducer synthesis, and N-acyl-homoserine lactone synthesis. We expect these approaches will lead to the discovery of new quorum-sensing inhibitors that can help to stem the tide of antibiotic resistance

Metodología para la obtención y evaluación de un extracto proteínico de una cepa autóctona de Helicobacter pylori

Helicobacter pylori es una bacteria gram negativa que posee numerosos antígenos que juegan un importante papel en la patogénesis de las enfermedades gastroduodenales. Debido a la necesidad de métodos de diagnóstico estandarizados con antígenos locales u autóctonos nos propusimos el diseño de una estrategia para la obtención de extractos de antígenos con reactividad frente a sueros de pacientes infectados por H. pylori. Dos cepas de H. pylori, una autóctona (IPK196A) y una de referencia ATCC 43504, se cultivaron en un medio líquido modificado. Se sometieron a los protocolos de ruptura por ultrasonido aplicándose tres variantes de precipitación y al fraccionamiento celular mediante ultracentrifugación diferencial. Los extractos proteínicos se visualizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfirieron para la detección de antígenos inmunorreactivos a sueros de pacientes con infección por H. pylori e individuos sanos. La variante de ultrasonido y precipitación con Coomasie fue la más efectiva para concentrar las muestras. El método de ultracentrifugación mejoró la resolución de las proteínas reactivas y permitió separarlas según su localización subcelular. El sistema de transferencia húmedo fue ideal para la inmunodetección de los antígenos obtenidos por ultrasonido mientras que el sistema semiseco permitió detectar las proteínas de membrana obtenidas por ultracentrifugación diferencial. La introducción de una metodología en el laboratorio para la obtención y evaluación de extractos proteínicos antigénicos a partir de cepas autóctonas de H. pylori, constituye la antesala para el diseño de futuros diagnosticadores y candidatos vacunales