Transporteurs d'ions dans des cellules d'épithélium rénal : rôle des purinocepteurs-P2, de la protéine kinase C et des protéines de choc thermique

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.Les anomalies de l'activité des transporteurs d'ions et de l'expression des protéines de choc thermique (HSPs) ont été décrites dans les reins d'animaux hypertendus. Nous nous sommes particulièrement intéressés aux co-transporteurs Na, K+, Cl- et Na, Pi. Les isoformes NKCC 1 et NKCC2 du co-transporteur Na, K+, Cl- sont inhibées par des diurétiques tels que le furosémide et le bumétanide et sont impliquées dans la sécrétion et la réabsorption transépithéliale du sodium et de l'eau. L'implication de l'isoforme NKCC 1 a aussi été démontrée dans la régulation du volume cellulaire, ainsi que dans la progression du cycle cellulaire et dans la prolifération. Le co-transporteur Na, Pi de type II joue un rôle majeur dans la réabsorption du phosphate par le tubule proximal, ainsi que dans la régulation des concentrations plasmatiques du phosphate inorganique et du Ca2+. La régulation de ces transporteurs est spécifique à chaque tissu et à chaque segment des tubules rénaux. Puisqu'il est connu que les HSPs sont impliquées dans la protection de certaines fonctions du transport transépithélial dans les tubules rénaux de poisson, notre hypothèse était que les HSPs modulent la régulation des transporteurs rénaux d'ions connus pour leur activité anormale dans l'hypertension artérielle. Toutefois, aucune étude n'avait évalué l'implication des HSPs dans la régulation des transporteurs d'ions dans des cellules d'épithélium rénal de mammifère. De plus, les HSPs peuvent jouer un rôle non seulement dans la modulation de l'activité basale des transporteurs d'ions, mais aussi dans leur régulation. Encore une fois, il n'existait aucune donnée sur ce sujet. Pour cette thèse de doctorat, nous avons donc choisi d'étudier un modèle physiologique d'épithélium rénal avant d'entreprendre des études sur un modèle pathologique tel que l'hypertension artérielle. Le but de nos travaux de recherche était d'examiner les voies de signalisation impliquées dans la régulation de différents transporteurs d'ions dans des cellules d'épithélium rénal de mammifère, ainsi que la modulation de ces transporteurs par le stress thermique et les HSPs. Nous avons choisi comme modèle d'épithélium rénal les cellules "Madin-Darby canine kidney" (MDCK) puisque cette lignée cellulaire a conservé, in vitro, plusieurs propriétés de l'épithélium rénal in vivo, dont le transport vectoriel et la régulation hormonale. De plus, des protéines de choc thermique HSPs peuvent être induites dans cette lignée. L'activité des transporteurs d'ions a été évaluée à l'aide d'isotopes radioactifs. L'effet des stress thermiques modéré et sévère, ainsi que du stress hyperosmotique, a été évalué. L'accumulation de l'ARN messager et l'expression des protéines HSP70 et HSP27 ont été étudiées par buvardages de type northern et western. Dans des études complémentaires, nous avons aussi mesuré les concentrations intracellulaires de Na, de K+, et de Cl- à l'aide d'isotopes radioactifs; les concentrations intracellulaires de Ca2+ à l'aide du fluo-3; la production d'inositol triphosphate par la mesure du composé marqué myo-[2-31P]-inositol et la phosphorylation de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) par immuno-buvardage de lysats cellulaires avec les anticorps anti-phospho ERK. Nous avons démontré que, dans les cellules MDCK, la régulation du co-transporteur Na, K+, Cl- s'effectue principalement via des voies de signalisation impliquant les isoformes de la protéine kinase C sensibles au 4β-phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) et via l'activation des purinocepteurs-P2X et/ou P2Y. Nous avons aussi démontré qu'aucun mécanisme connu de la signalisation induite par l'ATP n'est impliqué dans l'inhibition du co-transporteur Na, K+, Cl- par les purinocepteurs-P2X. Nos résultats suggèrent la présence d'une nouvelle voie de signalisation induite par les purinocepteurs-P2X. Le co-transporteur Na, Pi est aussi régulé par le PMA et par l'ATP. L'activation des purinocepteurs-P2 par l'ATP, ainsi que l'activation de la protéine kinase C par le PMA, diminuent de façon importante l'activité des co-transporteurs Na, K+, Cl- et Na, Pi. L'activité basale des co-transporteurs Na, K+, Cl- et Na, Pi est indépendante de la production des HSPs induites par le stress thermique. Nous avons observé que le stress thermique sévère augmente l'activité basale des co-transporteurs Na, K+, Cl- et Na, Pi et abolit complètement la régulation de ces transporteurs par le PMA, sans modifier significativement celle obtenue par l'activation des purinocepteurs-P2. La production de HSP70 induite par le stress thermique modéré n'empêche pas l'activation des co-transporteurs Na, K+, Cl- et Na, Pi à la suite d'un stress thermique sévère ni leur inhibition par les purinocepteurs-P2. En conclusion, dans les cellules MDCK, les purinocepteurs-P2 et les isoformes de la protéine kinase C sensibles au PMA sont impliqués dans la régulation de l'activité des co-transporteurs Na, K+, Cl- et Na, Pi par des mécanismes différents, l'un insensible et l'autre sensible au stress thermique, respectivement. Mais cette régulation est indépendante de l'induction des HSP70 et HSP27. De plus, la régulation du co-transporteur Na, K+, Cl- par les purinocepteurs-P2 ne se fait pas par les mécanismes connus de la signalisation induite par l'ATP. Compte tenu de l'importance relative des membranes apicale et basolatérale pour la fonction de plusieurs transporteurs rénaux d'ions, dont les co-transporteurs Na, K+, Cl- et Na, Pi, des travaux sur le rôle des HSPs dans la régulation de ces transporteurs dans des cellules d'épithélium rénal cultivées sur un support perméable méritent d'être entrepris

Bedeutung der WNK3-Kinase für die Salz-, Wasser- und Blutdruckhomöostase in vivo

Die Reabsorptionsprozesse der Niere leisten einen essentiellen Beitrag zur Salz-, Wasser- und Blutdruckhomöostase. Die Erforschung dieser Mechanismen ist ein wichtiges Element der Hypertonietherapie. In diesem Zusammenhang sind die sogenannten WNK-Kinasen, die die Aktivität renaler Ionentransporter regulieren, von besonderem Interesse. Die WNK3-Kinase spielt in vitro eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von NKCC2 und NCC. Das Ziel dieser Arbeit war daher, die Relevanz von WNK3 für die Nierenfunktion und die Blutdruckhomöostase in vivo zu klären. Hierzu wurden Versuche an WNK3-defizienten Mäusen durchgeführt. Es konnte kein relevanter renaler Phänotyp bei den WNK3-KO-Mäusen detektiert werden. Jedoch konnte eine signifikant gesteigerte WNK1-Expression nachgewiesen werden. Das Fehlen der WNK3-Kinase-Funktion scheint durch einen über die WNK1-SPAK/OSR1-Achse verlaufenden Mechanismus kompensiert zu werden. Die WNK3-Kinase scheint somit nur ein Teil eines Netzwerks von Kinasen zu sein, die an der Regulation der Nierenfunktion beteiligt sind

Inhibition de l'apoptose par inversion du rapport [Na⁺]ᵢ/[K⁺]ᵢ : preuve de l'existence de facteur(s) de transcription sensible(s) à la [Na⁺]ᵢ et rôle de la mortaline

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal

The influence of ACE (I/D) polymorphism in cardiovascular disease.

The renin-angiotensin system (RAS) is involved in maintenance of cardiovascular function and has been implicated in coronary heart disease (CHD) and type 2 diabetes (T2D). Pharmacological inhibition of the RAS improves cardiovascular disease outcomes. Angiotensin Converting Enzyme (principal component of RAS) levels are significantly associated with the ACE(I/D) polymorphism. Large studies have demonstrated a mild effect of this polymorphism on CHD risk. However the presence of RAS in diverse tissues implicated in cardiovascular diseases justify the hypothesis that genetic polymorphisms encoding proteins in this system 'modify' the risk of such diseases in the context of harmful stimuli or affect disease progression. This thesis therefore tested the hypothesis that the ACE(I/D) polymorphism 'modifies' risk of CHD and T2D, and affects progression of Hypertrophic Cardiomyopathy (HCM). Using a study of 532 myocardial infarction (MI) survivors and 574 controls (HIFMECH), an interaction between the ACE polymorphism and lipid levels on MI risk in Northern compared to Southern Europeans is demonstrated: the MI odds with high ApoB levels in D allele carriers was much greater in the North than the South. In a prospective cohort of 3052 healthy men (NPHS2), an interaction between ACE and systolic blood pressure (SBP) on CHD risk is presented where D allele carriers were protected against CHD at lower SBP, but at higher SBP were more susceptible. In the same study, ACE variants modified the risk of T2D in obese individuals, with obese D allele carriers having a substantially higher T2D risk compared to obese II homozygotes. From a retrospective study of 541 patients with HCM a possible effect of the polymorphism on left ventricular remodelling is demonstrated. Thus the work in this thesis offers strong evidence that the ACE gene modifies risk of CHD and T2D in the presence of known risk factors