Mutational analysis of HIV in Colombian patients

Objetivo. La resistencia a los medicamentos antirretrovirales se ha asociado con mutaciones características en los genes que codifican las enzimas que son el blanco de la terapia antirretroviral. En el presente trabajo se busca evaluar, desde el punto de vista cualitativo y cuantitativo, las diferentes mutaciones reveladas por la tipificación molecular de virus procedentes de diferentes pacientes remitidos al Instituto de Referencia Andino, en Bogotá, para la genotipificación con fines terapéuticos.Diseño: Se hizo la tipificación de un total de 1.064 mutaciones diferentes en virus procedentes de 16 pacientes no relacionados entre sí, con solicitud de genotipificación del VIH para análisis de sensibilidad a antirretrovirales. Se procedió a la tabulación de las mutaciones encontradas en cuatro categorías principales: a-mutaciones asociadas a resistencia, b- mutaciones silenciosas, c- polimorfismos genéticos por fuera de los sitios asociados a resistencia, y de mutaciones en sitios de resistencia que hasta el momento no han sido asociadas a resistencia.Metodología. Se seleccionaron, en estricto orden de llegada, 16 muestras de sangre en EDTA de pacientes con solicitud de genotipificación del VIH para análisis de sensibilidad a antirretrovirales. Se extrajo el ARN viral de cada muestra por el método QIAamp® y se procedió a su amplificación por medio de la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR). Una vez amplificado el ácido nucleico viral, se procedió a su tipificación molecular en el secuenciador LongReadTower-Opengene®, utilizando el estuche Trugene HIV-1®. Las secuencias obtenidas se transcribieron a hoja electrónica Excel®, y se hizo un cálculo de frecuencias de mutaciones por conteo directo. Resultados. Se revelaron por el método de secuenciación viral 1.064 mutaciones diferentes entre las que solamente 164 (15,4%) estaban asociadas a resistencia a los antirretrovirales (68 en el gen de la retrotranscriptasa o transcriptasa inversa y 96 en el gen de la proteasa). El 84,5% restante corresponde a polimorfismos (n=301), mutaciones silenciosas (n=564) y a otras mutaciones (n=35) que hasta el momento no han sido asociadas con resistencia, pero que pueden ser fuente de fracasos recurrentes en los tratamientos antirretrovirales. Se encontraron tres genotipos virales idénticos en tres pacientes de diferente procedencia en el país, lo cual puede constituir un indicador de utilidad ejemplar para la trazabilidad epidemiológica de esta virosis, en la medida en que la coincidencia de perfiles de mutación en virus aislados a partir de diferentes pacientes se puede asociar a la infección con una misma cepa circulante en una región determinada. Se presenta la cartografía molecular de las 1.064 mutaciones diferentes identificadas en 16 pacientes estudiados, enla cual se revelan codones cuya secuencia muta con mayor frecuencia. Entre los que están asociados con resistencia al tratamiento antirretroviral, se encontró que el codón 63 de la proteasa, con 18 mutaciones, y el codón 184 de la retrotranscriptasa, con 14 mutaciones, alojaron la mayor cantidad de variantes en losvirus secuenciados en este estudio preliminar. Conclusiones. La tipificación genética del VIH puede servir de fundamento molecular a investigaciones epidemiológicas, más allá de su evidente utilidad en el estudio de la resistencia a antirretrovirales, para lo cual se están utilizando exclusivamente estos análisis hoy en día.Artículo original350-370Objective: Resistance to antiretroviral drugs has been associated with characteristic mutations in the genes that encode enzymes which are the target of anti-retroviral therapy. In this paper we evaluate the different mutations revealed by molecular typing of viruses from different patients who were referred to be genotyped at the Instituto de Referenda Andino in Bogotá for therapeutic purposes. Design: A total number of 1064 mutations in viruses from 16 HIV infected unrelated patients were initially genotyped for the analysis of sensitivity to antiretrovirals. Afterwards, we proceeded to the tabulation of the mutations found in four main categories: a- resistance mutations, b- silent mutations, c-genetic polymorphisms outside of sites associated with resistance, and d- mutations at sites not yet associated with resistance. Materials and methods: Sixteen EDTA blood samples drawn from patients with HIV genotyping application for analysis of sensitivity to antiretroviral drugs were selected in strict order of arrival. Viral RNA was extracted from each sample by the QIAamp® method, and we then proceeded to its amplification by reverse transcriptase PCR (RT-PCR). Once the viral nucleic acid was successfully amplified, we proceeded to molecular typing in the sequencer LongRead-Tower-Opengene®, using the Trugene® HIV-1 kit. The sequences obtained were transcribed to an Excel® spreadsheet, to calculate the frequencies of mutations by direct counting. Results: We revealed 1064 viral mutations among which only 164 (15,4%) were associated with resistance to antiretroviral drugs (68 in the retrotranscriptase or reverse transcriptase gene and 96 in the protease). The remaining 84,5% corresponds to polymorphisms (n=301), silent mutations (n=564), and other mutations (n=35) that have not been associated with resistance so far: but can be a source of recurring failures on antiretroviral treatment. We also found three identical viral genotypes in 3 unrelated patients coming from different geographic areas in the country. This finding implies that viral genotyping can be a useful indicator for epidemiological tracking of this viral disease. We also report the molecular mapping of the 1064 mutations identified in all 16 patients studied, which show which codons mutate more frequently. Among these, the codon 63 of the protease, with 18 mutations, and codon 184 of the retrotranscriptase, with 14 mutations, housed the higher number of variants in the viruses that were sequenced in this preliminary’ study.Conclusions: Genetic typing of HIV can be the basis of molecular epidemiological investigations, beyond their obvious utility in the study of resistance to antiretroviral drugs for which these tests are used exclusively today