Estudio de la influencia de las tensiones tangenciales en el endotelio mediante un sistema microfluídico de placa de ateroma

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en todo el mundo. Entre ellas, la aterosclerosis es la etiología más común. La aterosclerosis consiste en el estrechamiento progresivo de un vaso sanguíneo debido a la deposición de una placa de ateroma. A pesar de la elevada incidencia de esta enfermedad, su mecanismo aún no se conoce completamente.La aterosclerosis es una patología localizada; por lo tanto, los factores sistémicos en sangre no son los únicos iniciadores de esta enfermedad. Las zonas más susceptibles de desarrollar aterosclerosis comparten patrones de flujo turbulento, debido principalmente a la presencia de bifurcaciones. Por todo esto, la biomecánica y la hemodinámica de esta patología están ganando cada vez mayor atención.A nivel celular, el flujo sanguíneo influye en el comportamiento de las células endoteliales de la pared del vaso. Estas células pueden modificar su forma y orientación, provocando una alteración en la permeabilidad de la pared. Un aumento de la permeabilidad del endotelio es el primer paso para desarrollar aterosclerosis. Por lo tanto, el estudio del efecto del flujo en la forma y orientación celular es esencial.En este trabajo, se ha desarrollado un ensayo experimental para estudiar las células endoteliales coronarias humanas (HCAECs) y su respuesta al flujo sanguíneo. En particular, el flujo se ha caracterizado mediante la tensión tangencial en la pared (WSS), tensión que experimentan las células debido al paso de la sangre. Para ello, se ha diseñado y fabricado un dispositivo microfluídico, se ha establecido el protocolo experimental y se ha desarrollado un programa de análisis de imágenes para posprocesar la información obtenida en el microscopio.Hasta ahora se han llevado a cabo dos lotes de experimentos. Se ha encontrado respuesta celular en términos de forma y orientación a los diferentes valores de WSS en todos los casos estudiados.<br /

Nuevas estrategias en el tratamiento del glioblastoma basadas en la regulación de la autofagia

El glioblastoma multiforme es uno de los tumores primarios más agresivos del sistema nervioso central, con una media de supervivencia que apenas supera el año a pesar del empleo de distintas modalidades terapéuticas. Se trata de un tumor que puede desarrollarse de novo o sobre una lesión preexistente. El tratamiento del glioblastoma se basa en la combinación de cirugía, radioterapia y quimioterapia, con el empleo de temozolamida. La temozolamida es el quimioterápico de elección en este tumor, y aunque parecía un medicamento prometedor, el desarrollo de resistencias por parte de las células tumorales dificulta el objetivo de regresión tumoral. Una de las alternativas para hacer frente a estas resistencias es la autofagia. Se trata de un proceso catabólico mediante el cual los orgánulos deteriorados son eliminados mediante su secuestro en unas vesículas denominadas autofagosomas. Este mecanismo es clave para mantener el equilibrio del medio interno y se pone en marcha ante situaciones de estrés celular, como ocurre en el déficit de oxígeno o hipoxia. Si bien en los estadíos tempranos del tumor, la autofagia constituye un mecanismo antineoplásico, una vez establecido el glioblastoma, puede favorecer la perpetuación tumoral, ya que, el elevado grado de hipoxia (característica de este tipo de tumores), pone en marcha el proceso autofágico para abastecer de energía y nutrientes a las células tumorales, contribuyendo así a su subsistencia. En relación a la regulacion de la autofagia en el tratamiento del glioblastoma, se barajan varias opciones, una sería la inhibición de este mecanismo, con el empleo de bloqueadores tempranos y tardíos, como la cloroquina; y otra la inducción del mismo a través del uso de los cannabinoides

Nuevas terapias frente al adenocarcinoma ductal pancreático

El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es uno de los tumores sólidos más difíciles de tratar. Representa la cuarta causa de muerte relacionado con el cáncer en el mundo, con una tasa de supervivencia a los 5 años inferior al 5%, mientras que la supervivencia a un año se logra en menos del 20% de los casos. Las opciones terapéuticas disponibles actualmente son muy limitadas y están altamente ligadas al estado de la enfermedad. Además, se ha demostrado que el PDAC es capaz de desarrollar una rápida regulación de vías compensatorias al tratamiento, así como una densa reacción desmoplásica, que le proporcionan resistencia frente a las terapias ya existentes. Entre las terapias la resección quirúrgica sigue siendo en la actualidad la principal opción terapéutica para los pacientes, pero desafortunadamente, menos del 20% de los pacientes son susceptibles de someterse a esta cirugía. De igual forma, el abordaje terapéutico de dicha enfermedad basado en la quimioterapia o la radioterapia, presentan una tasa de éxito muy baja. En pacientes tratados con gemcitabina, aceptado como fármaco quimioterapéutico de primera línea de referencia, la tasa de supervivencia general es de 5,6 meses, mientras que la tasa de supervivencia a un año es del 18%. Como alternativa a estas terapias clásicas surge la inmunoterapia que consiste en la inducción de una respuesta inmune que potencie la acción antitumoral que el organismo presenta frente al cáncer. Sin embargo, los resultados obtenidos han sido contradictorios debido a la naturaleza poco inmunológica del tumor, el privilegio inmunitario, el complejo microentorno tumoral y la plasticidad genética de las células. Una de las principales dificultades que surgen en el estudio de nuevas terapias es la falta de modelos experimentales que reproduzcan el complejo entorno tumoral. En los últimos años se han desarrollado nuevos modelos preclínicos basados en el cultivo tridimensional que permiten recrear la interacción entre los diferentes tipos de células presentes en el microentorno tumoral, así como mimetizar la arquitectura celular y el medio inmunosupresor de una forma más parecida a la real.<br /

LA INMUNOTERAPIA Y LOS NUEVOS ENFOQUES TERAPÉUTICOS FRENTE AL GLIOBLASTOMA MULTIFORME

El glioblastoma multiforme, subtipo más común y agresivo de los gliomas cerebrales, conlleva un pronóstico sombrío. A pesar de los avances en las técnicas de diagnóstico y tratamiento, su supervivencia no supera los 5 años en el mejor de los casos.El glioblastoma está siendo cada vez más estudiado y, poco a poco se va comprendiendo mejor cuál es su patogenia y su comportamiento tumoral. Actualmente, la estrategia terapéutica inicial incluye un enfoque agresivo que combina resección quirúrgica, radiación y quimioterapia con temozolamida. Sin embargo, la recurrencia y/o progresión del proceso tumoral es prácticamente segura.Durante los últimos años, la inmunoterapia ha surgido como otra posible vía terapéutica, apareciendo diversas líneas de investigación en la búsqueda de un tratamiento eficaz frente al glioblastoma. Tres de estas principales corrientes son la inhibición de los puntos de control, el uso de las células CAR-T o la administración de vacunas de células dendríticas. Se han llevado a cabo diversos ensayos clínicos para evaluar la efectividad de estos tratamientos basados en la inmunoterapia tanto en monoterapia como en combinación con la terapia estándar, como es el caso de las células CAR-T para el receptor EGFRvIII o HER-3, o la vacuna rindopepimut.Si bien la inmunoterapia ha ofrecido grandes avances en el tratamiento de diversos procesos tumorales, potenciando al propio sistema inmunitario del paciente para lograr hacer frente al proceso cancerígeno; en el caso del glioblastoma todavía no se han podido alcanzar esos beneficios y sigue siendo un campo de continuo estudio y desarrollo. <br /

La interacción entre las células natural killer y el cáncer: nuevas perspectivas para la inmunoterapia.

Las células natural-killer (NK) constituyen un subtipo celular linfoide de la inmunidad innata altamente especializado en la función efectora citotóxica, hecho que las involucra en la primera línea de defensa frente a agentes infecciosos y células neoplásicas. La implicación de las células NK en la modulación inmune del cáncer es un hecho constatado. Dicha regulación se fundamenta en la capacidad que presentan para diferenciar entre células sanas y anormales, proceso que ocurre mediante la valoración de señales procedentes de receptores activadores e inhibidores ubicados en la membrana plasmática de las células NK. Por otra parte, el microentorno tumoral es capaz de modificarse como consecuencia de sus interacciones con la inmunidad, hecho que puede comprometer la funcionalidad de las células NK hasta el punto de conducir a la destrucción del tumor o a su evasión del control inmune. Estas vías de escape incluyen la secreción de factores inmunosupresores, la represión y/o sobreexpresión de ciertos ligandos y el reclutamiento de otras células inmunes de actividad inhibidora sobre las células NK. La caracterización funcional y propiedades únicas de las células NK las convierten en excelentes candidatos para distintos tipos de tratamientos, como la transferencia adoptiva de células y el trasplante de células madre hematopoyéticas. Sin embargo, su aplicabilidad en clínica se ve restringida por varios factores, como su limitada supervivencia y/o la baja capacidad de expansión que presentan. El abordaje de estas carencias es posible mediante medidas de preactivación y de ingeniería genética. Estas vertientes, capaces de amplificar el potencial efector de las células NK, incluyen el desarrollo de receptores quiméricos de antígenos (CARs), el bloqueo de receptores con función inhibidora y el diseño de anticuerpos biespecíficos.<br /

La importancia de los macrófagos en el Glioblastoma Multiforme

El glioblastoma multiforme (GBM) es el tumor primario más frecuente del sistemanervioso central con una supervivencia media a los 5 años del 5,5% de los pacientes.Actualmente, el tratamiento de esta tumoración es muy agresivo; incluyendo unaresección máxima de la tumoración, radioterapia y quimioterapia. Sin embargo, estetratamiento no es suficiente para disminuir el índice de mortalidad, por lo que suponetodo un reto para la comunidad medica y científica buscar nuevos tratamientos másefectivos. En condiciones normales los macrófagos presentes en el microentorno tumoraldeberían luchar a favor del organismo, enfrentándose y eliminando las células tumorales.Sin embargo, las células del glioblastoma son capaces de reprogramar a estos macrófagoshaciendo que actúen a su favor y promoviendo la progresión y proliferación celular. Unaposible nueva vía terapéutica podría estar basada en la re-educación o reprogramaciónde los macrófagos presentes en el microentorno tumoral. Por lo tanto, una mejorcompresión de los procesos que inducen este cambio en los macrófagos y del modo enque se podría revertir, alentará en el futuro al desarrollo de nuevas terapias.<br /

Nuevas estrategias en el manejo del glioblastoma basadas en las células tumorales circulantes

El glioblastoma multiforme (GBM) es el tumor intracraneal primario más frecuente y, a su vez, el que peor pronóstico tiene debido a su elevada malignidad, con una media de supervivencia que apenas supera el año. Se trata de un tumor que puede aparecer de novo o desarrollarse sobre una lesión preexistente. Actualmente, el principal tratamiento para el GBM consiste en la resección quirúrgica del tumor, siempre que sea posible, seguido por la aplicación de radioterapia y un tratamiento adyuvante de quimioterapia con temozolamida. Sin embargo, la respuesta al tratamiento es poco satisfactoria, siendo un tumor con una elevada tasa de recurrencia postquirúrgica y con un elevado riesgo de necrosis tras la aplicación de la radioterapia. El aislamiento y caracterización de las células tumorales circulantes (CTCs) es un aspecto de creciente interés ya que podría estar estrechamente relacionado con el manejo de los pacientes con GBM. En la actualidad se están desarrollando técnicas más sensibles y específicas para poder aislar y estudiar estas células de sangre periférica. Dentro de estas nuevas tecnologías destacan los que se basan en el reconocimiento de marcadores de superficie o genes específicos para estas células, así como sistemas basados en mecanismos microfluídicos, como los CTC-iChip. También el empleo de métodos para la detección de células tumorales basados en adenovirus, que localizan la actividad telomerasa incrementada, o el análisis mediante FISH de la poliploidía del cromosoma 8 son algunas de estas tecnologías. Estos sistemas de detección podrían jugar un papel fundamental en algunos aspectos clínicos significativos del manejo del GBM, como podrían ser la respuesta al tratamiento quimoterápico, principalmente con temozolomida, así como el pronóstico de la enfermedad o la diferenciación entre recurrencia y radionecrosis podrían ser analizados en función de los CTCs presentes en la sangre de los pacientes.<br /

Cold-shock proteins accumulate in centrosomes and their expression and primary cilium morphology are regulated by hypothermia and shear stress

Primary cilia act as cellular sensors for multiple extracellular stimuli and regulate many intracellular signaling pathways in response. Here we investigate whether the cold-shock proteins (CSPs), CIRP and RBM3, are present in the primary cilia and the physiological consequences of such a relationship. R28, an immortalized retinal precursor cell line, was stained with antibodies against CIRP, RBM3, and ciliary markers. Both CSPs were found in intimate contact with the basal body of the cilium during all stages of the cell cycle, including migrating with the centrosome during mitosis. In addition, the morphological and physiological manifestations of exposing the cells to hypothermia and shear stress were investigated. Exposure to moderately cold (32°C) temperatures, the hypothermia mimetic small molecule zr17-2, or to shear stress resulted in a significant reduction in the number and length of primary cilia. In addition, shear stress induced expression of CIRP and RBM3 in a complex pattern depending on the specific protein, flow intensity, and type of flow (laminar versus oscillatory). Flow-mediated CSP overexpression was detected by qRT-PCR and confirmed by Western blot, at least for CIRP. Furthermore, analysis of public RNA Seq databases on flow experiments confirmed an increase of CIRP and RBM3 expression following exposure to shear stress in renal cell lines. In conclusion, we found that CSPs are integral components of the centrosome and that they participate in cold and shear stress sensing

Cold-shock proteins accumulate in centrosomes and their expression and primary cilium morphology are regulated by hypothermia and shear stress

Primary cilia act as cellular sensors for multiple extracellular stimuli and regulate many intracellular signaling pathways in response. Here we investigate whether the cold-shock proteins (CSPs), CIRP and RBM3, are present in the primary cilia and the physiological consequences of such a relationship. R28, an immortalized retinal precursor cell line, was stained with antibodies against CIRP, RBM3, and ciliary markers. Both CSPs were found in intimate contact with the basal body of the cilium during all stages of the cell cycle, including migrating with the centrosome during mitosis. In addition, the morphological and physiological manifestations of exposing the cells to hypothermia and shear stress were investigated. Exposure to moderately cold (32°C) temperatures, the hypothermia mimetic small molecule zr17-2, or to shear stress resulted in a significant reduction in the number and length of primary cilia. In addition, shear stress induced expression of CIRP and RBM3 in a complex pattern depending on the specific protein, flow intensity, and type of flow (laminar versus oscillatory). Flow-mediated CSP overexpression was detected by qRT-PCR and confirmed by Western blot, at least for CIRP. Furthermore, analysis of public RNA Seq databases on flow experiments confirmed an increase of CIRP and RBM3 expression following exposure to shear stress in renal cell lines. In conclusion, we found that CSPs are integral components of the centrosome and that they participate in cold and shear stress sensing. Histol Histopatho

Alteración de la autofagia y su modulación por una dieta rica en lípidos en un modelo murino de Esclerosis Lateral Amiotrófica

La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa que se caracteriza por una afectación y pérdida selectiva de las motoneuronas y por una progresiva debilidad muscular. Los mecanismos fisiopatológicos causantes de esta enfermedad no se conocen todavía, pero en los últimos años, entre las muchas teorías propuestas, se postula que la acumulación de proteínas anormalmente plegadas podría estar relacionada con el desarrollo de la enfermedad. Los dos principales mecanismos que participan en la proteostasis celular son la autofagia y el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), y ambos procesos pueden ser esenciales para la reducción de la toxicidad mediada por la proteína SOD1 mutada. En esta Tesis Doctoral se han estudiado los procesos de degradación proteica mediada por la autofagia y por el proteasoma, así como los procesos de muerte celular programada a lo largo de la enfermedad en el músculo esquelético y la médula espinal en el modelo murino SOD1G93A. En un primer lugar, para eliminar el sesgo por el efecto del género en los procedimientos experimentales, se determinaron las diferencias existentes entre machos y hembras en la autofagia constitutiva en el músculo esquelético y la médula espinal de ratones wild type. Los resultados obtenidos indican que existen diferencias en los marcadores de autofagia objeto de estudio (LC3 y p62) entre ambos sexos, y además estas diferencias son específicas del tejido estudiado. Después de confirmar la necesidad de incluir grupos experimentales balanceados para el sexo, se ha estudiado la activación de la autofagia y el proteasoma en el músculo esquelético de los ratones modelo a lo largo de la enfermedad. Los datos obtenidos indican una alteración en la actividad del proteasoma en los estadios estudiados y un aumento de la autofagia en el estadio terminal de la enfermedad. Además el análisis del proceso de muerte celular por apoptosis, indica que no se producen una activación significativa de la misma en la progresión de la enfermedad. Por otra parte, se han comparado distintas pruebas de comportamiento para conocer cuál de ellas es la más adecuada para poder evaluar el efecto de un posible tratamiento en nuestros ratones modelo. Los resultados obtenidos muestran que tanto el test de rotarod como de la rejilla, son las pruebas más sensibles para detectar fallos tempranos en el comportamiento motor de los ratones, y además estas pruebas permiten realizar una adecuada caracterización del comportamiento motor de dichos animales. Posteriormente, se realizó un ensayo pre-clínico consistente en la administración de una dieta enriquecida en lípidos, concretamente con aceite de oliva extra virgen y con aceite de palma, en los ratones modelo. La ingestión de la dieta enriquecida con aceite de oliva extra virgen mejora el comportamiento motor y aumenta la supervivencia de los animales, además de mejorar el estado del músculo como lo evidencia el aumento del grosor de las fibras. Tal y como esperábamos, esta dieta produce una mejora de los indicadores moleculares de la autofagia y de los parámetros asociados al estrés del retículo endoplasmático y al daño muscular en el estadio terminal de la enfermedad. Finalmente, puesto que los procesos de muerte celular programada han sido ampliamente estudiados en la médula espinal, pero no los procesos de degradación proteica, se ha llevado a cabo el estudio de los mismos en dicho tejido. El análisis de estos mecanismos a lo largo de la enfermedad en el modelo animal indica que la autofagia no tiene un papel tan relevante como en el músculo esquelético, y el proteasoma se encuentra activado sólo en estadios terminales de la enfermedad. Las alteraciones observadas en los procesos de degradación proteica objeto de estudio a lo largo de la enfermedad se presentan como una posible diana terapéutica, tal como se ha demostrado con la administración de una dieta enriquecida con aceite de oliva extra virgen