The influence of 2-hydroxyoleic acid on the artificial lipid membranes in the context of anticancer mechanism of action of the drug

W ramach niniejszej rozprawy doktorskiej podjęto próbę analizy wpływu kwasu 2-hydroksyoleinowego (2OHOA) - leku o działaniu antynowotworowym - na właściwości modelowych błon komórkowych, utworzonych przez główne lipidowe składniki ludzkich biomembran. Pomimo udowodnionych właściwości przeciwnowotworowych, mechanizm działania tej substancji na poziomie molekularnym wciąż wymaga weryfikacji. Dlatego celem pracy było zbadanie wpływu 2OHOA na stopień uporządkowania, stabilność, płynność i przepuszczalność modelowych membran, a także charakter oddziaływań pomiędzy cząsteczkami tej substancji i cząsteczkami wybranych lipidów błonowych w kontekście antynowotworowego mechanizmu działania tego leku. Zakładając, że dostarczanie 2OHOA w liposomach o dodatnim ładunku może zwiększyć skuteczność przeciwnowotworową badanej substancji, poza eksperymentami na modelach błon komórkowych, wykonano także badania dotyczące określenia właściwości fizykochemicznych potencjalnych nośników 2OHOA zawierających lipid kationowy. Praca została podzielona na pięć głównych części. W części pierwszej - literaturowej, przedstawiono charakterystykę błon biologicznych, z uwzględnieniem nieprawidłowości w składzie lipidowym biomembran wynikających z procesów nowotworzenia. Omówiono także koncepcję lipidowych terapii membranowych (MLT) oraz dokonano przeglądu substancji wykazujących potencjał antynowotworowy, których działanie opiera się na mechanizmie MLT. W części tej zawarto również opis dotychczasowego stanu wiedzy na temat mechanizmu działania kwasu 2-hydroksyoleinowego. Następnie wyjaśniono zasadność korzystania z układów modelowych w badaniach na błonami biologicznymi - opisano monowarstwy Langmuira, liposomy oraz membrany na podłożach stałych jako układy, które umożliwiają śledzenie procesów zachodzących w naturalnych membranach. Przedstawiono podstawy teoretyczne oraz charakterystykę zastosowanych w pracy technik eksperymentalnych. Druga część pracy obejmuje opis materiału badawczego, procedur pomiarowych oraz szczegółowe omówienie składu przebadanych modelowych membran. Eksperymenty zostały przeprowadzone dla jednoskładnikowej monowarstwy kwasu 2-hydroksyoleinowego, układów dwuskładnikowych oraz wieloskładnikowych. Stworzono modelowe membrany zewnętrznej warstwy błon komórkowych ssaków, raftu lipidowego, a także porównawcze modele błon komórek zdrowych (fibroblastów i leukocytów) oraz nowotworowych (czerniaka - linia B16 i białaczki - linie K-562 i HL-60). Wykonano również jedno- i dwuwarstwowe układy zawierające lipid kationowy, będący składnikiem potencjalnych nośników leku antynowotworowego. Kwas 2-hydroksyoleinowy był wprowadzany do powyższych układów w szerokim zakresie ułamków molowych. W części trzeciej zaprezentowano wyniki eksperymentów przeprowadzonych na modelach jednowarstwowych wraz z ich charakterystyką dokonaną w oparciu o izotermy ciśnienia powierzchniowego w funkcji powierzchni przypadającej na cząsteczkę, parametry obliczone na podstawie zarejestrowanych krzywych oraz obrazy uzyskane techniką mikroskopii kąta Brewstera. Dla wybranych modelowych membran zamieszczono także opis fizykochemicznych właściwości liposomów, stworzony na podstawie wyników pomiarów dynamicznego rozpraszania światła, potencjału zeta, anizotropii fluorescencji znacznika fluorescencyjnego oraz miareczkowania spektrofluorymetrycznego. Rezultaty eksperymentów przeprowadzonych na modelach jednowarstwowych i dwuwarstwowych charakteryzowały się dużą zgodnością. W rozdziale stanowiącym czwartą część pracy przeprowadzono dyskusję otrzymanych wyników. Na podstawie zestawienia obliczonych wartości wybranych parametrów przeanalizowano wpływ struktury fosfolipidów na oddziaływania z kwasem 2-hydroksyoleinowym. Następnie oceniono efekt działania 2OHOA na wieloskładnikowe układy lipidowe stanowiące modele zewnętrznej warstwy błon komórkowych ssaków oraz raftu lipidowego. Dokonano także analizy wpływu badanego leku na właściwości modelowych błon komórek normalnych i patologicznych. Dodatkowo omówiono wpływ kwasu 2-hydroksyoleinowego na parametry układów zawierających lipid kationowy, w kontekście potencjalnego zastosowania liposomów obdarzonych ładunkiem dodatnim, jako nośników 2OHOA. W ostatniej części pracy zawarto wnioski oparte o zaprezentowane wyniki badań. Stwierdzono, że w stosunku do monowarstw bardziej skondensowanych, o silnych, korzystnych oddziaływaniach międzycząsteczkowych kwas 2-hydroksyoleinowy wykazuje wyraźniejsze właściwości upłynniające i powoduje osłabienie oddziaływań przyciągających. Wbudowywanie się 2OHOA w strukturę raftów lipidowych jest korzystne termodynamicznie i wywołuje silną zmianę właściwości mikrodomen. Fakt ten może stanowić potwierdzenie szczególnej roli tych struktur w antynowotworowym mechanizmie działania badanego leku. 2OHOA charakteryzuje się większym powinowactwem w stosunku do dwóch przebadanych modeli linii komórek nowotworowych w porównaniu do ich nienowotworowych odpowiedników, co może wskazywać na jego selektywność w kierunku komórek patologicznych. Obdarzone dodatnim ładunkiem powierzchniowym liposomy EPOPC/DOPC/2OHOA, dzięki swoim właściwościom fizykochemicznym, mogą poprawić efektywność dostarczania 2OHOA do komórek patologicznych.The main objective of the doctoral thesis was to investigate the effect of the anticancer drug - 2-hydroxyoleic acid (2OHOA) - on the properties of model membranes formed from lipids being the main components of human cell membranes. Unfortunately, despite a confirmed anticancer activity of 2OHOA, the mechanism of action of this drug at the molecular level still requires verification. Therefore, the presented work is focused on the analysis of the influence of 2OHOA on the intermolecular interactions, stability, fluidity, permeability and molecular organization of artificial lipid membranes in the context of membrane-related anticancer properties of this drug. Furthermore, based on the assumption that the administration of 2OHOA molecules in positively charged liposomes may enhance bioavailability of this molecule, the studies of the effect of 2OHOA on the physicochemical properties of the cationic lipid - containing monolayers and bilayers were also performed. The presented work is composed of five main parts. In the first one - a literature part the characteristic of biological membranes including also the disorders in the lipid composition of these structures resulting from neoplastic processes is presented. In this section the concept of membrane lipid therapy (MLT) is discussed along with a review of the MLT drugs with anti-cancer potential. This part also contains a description of the current state of knowledge on the mechanism of action of 2-hydroxyoleic acid. Subsequently, the usefulness of Langmuir monolayers, liposomes and solid supported lipid bilayers as model systems in biological membrane studies was explained. At the end of this section the theoretical basis and the characteristic of the experimental techniques applied in the work were presented. The experimental part includes a description of the used substances and the procedures of measurements as well as detailed information on the compositions of the examined model membranes. The third part of the work presents the results of the experiments carried out on Langmuir monolayers, together with their characteristic based on the surface pressure-area isotherms and Brewster angle microscopy images. For selected model systems, the analysis of physicochemical properties of liposomes is also included. The results of the experiments carried out on monolayer and bilayer systems stays in well agreement. In the next chapter, the obtained results are discussed. On the basis of the comparison of the values of calculated parameters, the effect of the phospholipid structure on the interactions with 2-hydroxyoleic acid was analyzed. Afterwards the effect of 2OHOA on multicomponent lipid systems used as models of outer leaflet of mammalian cell membranes and lipid rafts was evaluated. Then the analysis of the influence of the drug on the properties of normal and pathological model membranes was also performed. Additionally, the influence of 2-hydroxyoleic acid on the systems containing cationic lipid was discussed, in the context of the potential application of positively-charged liposomes as 2OHOA carriers. The last part of the work contains conclusions drawn based on the presented results. It was found that the more condensed the initial monolayer, the stronger fluidizing effect of 2-hydroxyoleic acid. The incorporation of 2OHOA into the raft-like system is thermodynamically favourable and causes strong alterations in the properties of the microdomains. This fact may confirm the special role of these structures in the anti-cancer mechanism of action of the studied drug. Moreover, 2OHOA shows higher affinity to models of tumor cell membranes as compared to their non-tumour analogues, which may indicate its selectivity towards pathological cells. And finally, EPOPC/DOPC/2OHOA liposomes, due to their physicochemical properties and the positive surface charge, can improve the efficiency of 2OHOA delivery to cancer cells

The investigations of lipid monolayers mimicking biological membranes

Celem pracy było zbadanie wpływu desmosterolu na monowarstwy lipidowe imitujące naturalne membrany, zbadanie możliwości zastępowania cholesterolu jego prekursorem w błonach biologicznych, a także dokonanie analizy wpływu struktury grupy hydrofilowej, na właściwości filmów dwuskładnikowych. Badaniom poddano układy złożone z desmosterolu i fosfolipidów wchodzących w skład błony ludzkich erytrocytów, takich jak: fosfatydylocholina, sfingomielina, fosfatydyloetanoloamina oraz fosfatydyloseryna. Analizy właściwości monowarstw dokonano w oparciu o izotermy ciśnienia powierzchniowego w funkcji powierzchni przypadającej na cząsteczkę, parametry obliczone na podstawie zarejestrowanych krzywych oraz obrazy otrzymane techniką mikroskopii kąta Brewstera. Badania wykazały, iż desmosterol posiada słabsze właściwości kondensujące, porządkujące oraz domenotwórcze w stosunku do cholesterolu, a stopniowe zastępowanie cholesterolu jego prekursorem prowadzi do znaczących zmian w organizacji błon lipidowych i jedynie niewielki dodatek desmosterolu nie powoduje zmian właściwości układu. Ponadto wykazano, iż efekt kondensujący i porządkujący desmosterolu jest uzależniony od struktury grup hydrofilowych cząsteczek fosfolipidów.The analysis of the interactions between desmosterol and membrane lipids were performed in order to compare the effect of cholesterol and its precursor in a model membranes and to investigate the influence of lipid hydrophilic group structure on membrane properties. The investigations were performed for desmosterol and phospholipids present in human erythrocyte membrane: sphingomyelin, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine and phosphatidylserine. From the Langmuir monolayers technique the surface pressure – area isotherms were obtained and then the excess area of mixing values and the compression modulus values were estimated. This analysis was completed by application of Brewster Angle Microscopy to describe the morphology of the investigated films. The obtained results provide that desmosterol causes lower contraction of the area, weaker ordering effect and is lower domains promoting than cholesterol. Moreover, the gradual replacement of cholesterol by desmosterol causes changes in properties of investigated monolayers. It was also found that condensing and ordering effect of desmosterol depends on the hydrophilic groups structure of phospholipid molecules