Proton pump inhibitorを用いての新しい消化器癌治療戦略

いずれもp53変異株であり、通常の抗癌剤ではアポトーシスを起こしにくい5種類の膵癌細胞株(Capan-1,AsPC-1,BxPC-3,Panc-1,MIAPaCa-2)および7種類の大腸癌細胞株(SW48,SW480,SW620,CaR-1,colo320-DM,HT29,DLD-1)に対するbafilomycin A1のID_(72時間培養,MTT assay法)は5nM-40nMときわめて高い感受性を示した。そして、bafilomycin A1や25-C prodigiosinの液胞型プロトンポンプ阻害剤は、Capan-1膵癌細胞のヌードマウス皮下移植腫瘍に対して有意に腫瘍の増殖を抑制し、病理組織学的には癌細胞の縮小や核の濃縮などアポトーシスに特徴的な所見が観察された。次に、最もアポトーシス抵抗性の強いHT-29を用いて、アポトーシスに至る経時的推移について検討したところ、細胞膜表面の微絨毛の減少およびブレブ形成、細胞膜表面へのPS基の表出はbafilomycin A1処理24時間目から、細胞の縮小および核クロマチンの凝集や分断化は処理48時間目から観察された。アポトーシス関連蛋白の経時的推移では、bafilomycin A1処理でp53蛋白の発現は増強せず、またp21^蛋白の発現も終始誘導されなかった。Bcl-2、Bcl-XL蛋白の発現程度には変化がみられず、Bax蛋白は発現しなかった。カスパーゼ蛋白分解酵素ではカスパーゼ3、カスパーゼ9は処理後48時間目から活性体が観察されたが、カスパーゼ6、カスパーゼ7の活性体は認められなかった。加えて、この一連のアポトーシスの誘導はイミダゾール投与によって抑制されなかった。これらの成績より、bafilomycin A1によって誘導されるアポトーシスは、癌細胞のp53蛋白のstatusや細胞周期とは無関係に誘導されるものであり、しかもカスパーゼ9およびカスパーゼ3を介したミトコンドリア依存性経路であることが示唆された。以上より、液胞型プロトンポンプを標的にしたbafilomycin A1を用いての消化器癌治療の有用性が示唆された。The effect of bafilomycin A1 on tumor growth in vitro and in vivo was examined using an MTT assay and an in vivo tumor model. Five pancretic cancer cell lines seven colon cancer cell lines were used in this study. The ID 5 0 of bafilomycin A1 by the MTT assay was from 5 nM to 40 nM in every cell lines. Phosphatidylserine externalization of cancer cells was found 24 hr after bafilomycin A1 treatment. In DNA analysis, a ladder of fragmented DNA was detected 48 hr after bafilomycin A1 treatment. Morphologically, cancer cells showed cytoplasmic blebbing and a decreased number of microvilli 24 hr after the treatment, and the characteristic morphological changes of apoptosis, including nuclear chromatin condensation and fragmentation, loss of microvilli and cell shrinkage, were observed 48 hr after the treatment. Caspase 3 and caspase 9 proteins were activated 48 hr after treatment, however, caspase 6 and caspase 7 proteins were not activated during the treatment by Western blotting, suggesting a mitochondria-dependent apoptotic pathway. These apoptotic changes were not inhibited by 10 mM imidazole treatment. Next, nude mice bearing a xenografted Capan-1 cell line tumor received 4 weeks of bafilomycin A1 (1.0 mg/kg/day). This treatment significantly inhibited tumor growth compared with controls after 21 days. 25C-prodigiosin also showed the same inhibitory effect on a xenografted Capan-1 cell line tumor. Histopathological examination of tumor cells in the treatment group demonstrated signs of apoptosis with chromatin condensation and cell shrinkage. These observations suggest that bafilomycin A1 inhibits the growth of human colon and pancreatic cancer cells through apoptosis.研究課題/領域番号:09671290, 研究期間(年度):1997-1999出典：「Proton pump inhibitorを用いての新しい消化器癌治療戦略」研究成果報告書　課題番号09671290 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

G蛋白質共役型受容体を介した膵癌細胞の増殖・浸潤促進,抗アポトーシス機構の解明

G蛋白質共役型受容体は、7回膜貫通型の受容体で、細胞質内でG蛋白とcouplingして、増殖、運動、抗アポトーシスなどに関するシグナルを核へ伝達する作用を有することが知られている。今回、我々は、すでに膵癌組織内での過剰発現が確認さているアンギオテンシンII(Ang II)と腫瘍トリプシン、さらにはリゾホスファチジン酸(LPA)などの分子群にも注目し、それぞれの特異的受容体(AT1,PAR-2および(EDG)-2,-4)を介した膵癌細胞における細胞内シグナル伝達系について検討した。さらにこれらシグナルを介した刺激伝達の膵癌病理組織に及ぼす影響についても検討した。得られた結果は以下のように要約される。AT1、PAR-2およびEDG-2,-4受容体蛋白は、検索したすべての膵癌細胞株で発現しているのが確認された。そして、AngIIとトリプシンはそれぞれの受容体を介して膵癌細胞の増殖を濃度依存性に促進させた。また、ERK1/2やNF-κ8を活性化することで、膵癌細胞増殖を促進し、抗癌剤抵抗性を増強することが示された。さらに、腫瘍トリプシンの発現のないPanc-1にcationic typeのtrypsinogenを遺伝子導入しところ、遺伝子導入された細胞ではその増殖や運動・浸潤能が亢進した。すなわち、腫瘍から分泌され、その後活性化されたトリプシンがPAR-2を介して膵癌細胞の増殖と運動・浸潤能を亢進したものと考えられた。一方、膵癌細胞株では、LPA刺激に対し、その濃度が1μM濃度までは、膵癌細胞の有意な増殖効果は認められなかった,さらには、ERK1/2の明らかなリン酸化も確認できなかった。この結果は、Ang IIやトリプシンがnMレベルでシグナル伝達がおこなわれたのと対照的であった。最後に、ヒト膵癌組織(外科切除標本)におけるトリプシン、PAR-2およびAT1発現と組織内Ang II濃度(手術時に採取)の関係を検討した。その結果、膵癌細胞でのトリプシンおよびPAR-2発現の強い症例ほど膵癌組織内の間質の線維化の程度が強く、また、組織内アンギオテンシンII濃度も高いという傾向が認められた。このAng IIは、RAS非依存性にトリプシンによって直接アンギオテンシノーゲンから直接産生されることより、膵癌細胞から産生されるトリプシンおよびそのトリプシンによって産生されるAng IIは、それぞれの特異的受容体を介して、膵癌細胞の生存と抗アポトーシス能だけでなく、膵星細胞や線維牙細胞(いずれの細胞もPAR-2とAT1受容体の発現がある)にもパラクライン的に作用して膵癌間質の線維増生(fibrogenesis)に深く関与していることが推察された。Recently, angiotensin II (Ang II), trypsin and lysophosphatidic acid (LPA) has attracted considerable attention because activation of their specific G-protein-coupled receptors (AT1, PAR-2, and EDG-2,-4) can induce G protein-mediated signal transduction and is involved in a number of physiologic and pathologic processes such as inflammation and tumor progression. The purpose of this study was to investigate whether tumor-derived angiotensin II, trypsin and LPA plays an important role in the proliferation and survival of human pancreatic cancers through their specific G-protein-coupled receptors. As a result, all three pancreatic cancer cell lines (AsPC-1, BxPC-3, and Panc-1) studied, from well to poorly differentiated types, showed a moderate to strong expression of AT1, PAR-2 and EDG-2,-4 receptors. As to the signal transduction of pancreatic cancer cells, angiotensin II and trypsin stimulated the growth of pancreatic cancer cells even at the concentration of 100 nM or less through MAP kinase activation, and prevented cisplatin (CDDP)-induced apoptosis through NF-kB activation and the subsequent production of anti-apoptotic molecules, including Survivin and Bcl-XL. However, LPA did not stimulated the growth of pancreatic cancer cells at the concentration of less than 1 μM. In summary, it is suggested that not only tumor-derived angiotensin II but also tumor-derived trypsin must be a very potent mitogen and play a pivotal role in the growth and chemoresistance of AT1-positive and/or PAR-2 positive pancreatic cancer cells. Elucidation of the signal transduction machinery activated by tumor-derived angiotensin II and/or trypsin may provide insight into the molecular mechanisms underlying growth and chemoresistance of pancreatic cancers and ultimately lead to novel chemotherapies.研究課題/領域番号:16591304, 研究期間(年度):2004-2006出典：「G蛋白質共役型受容体を介した膵癌細胞の増殖・浸潤促進,抗アポトーシス機構の解明」研究成果報告書　課題番号16591304 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

Total syntheses of indole alkaloids, annonidine A and 7-(3-metheyl-2-buten-1-YL)indole

金沢大学大学院自然科学研究科生理活性物質科学金沢大学薬学

PPAR-γ核内受容体分子を標的にした新しい膵癌治療

転写制御因子であるるperoxisome proliferator activated receptor-γ(PPAR-γ)は、retinoid X receptor(RXR)と二量体を形成し、それぞれのリガンド結合に依存してPPAR応答性部位と呼ばれる特異的なDNA塩基配列に選択的に結合して転写を制御する核内受容体である。我々は、消化器癌のなかでも大腸癌のみならず膵癌にも高率にPPAR-γ蛋白が過剰に発現していることに注目し、PPAR-γ核内受容体分子を標的とした新しい膵癌治療が可能か否かを研究した。[材料]分化度の異なる5種類の膵癌細胞株を使用した。[結果]PPAR-γの特異的リガンドであるthiazolidinedione(TZD)処理により、膵癌細胞の増殖が濃度依存性に抑制(clonogenic assayでのED50値は1-5μM)された。また、cell cycle調節因子であるp21Waf-1蛋白が強く誘導され、cytostatic(flow cytometryでG1 arrestが観察される)に癌細胞の増殖が抑制された。さらに、TZD処理によりE-cadherinの癌細胞膜での発現増強(分化誘導)に伴って、細胞質内のtyrosine phosphorylationを受けたβ-catenin(蛋白量には変化なし)が減少し、β-cateninの局在が細胞質から細胞膜(細胞骨格系蛋白)へとtranslocationした。そして、癌細胞間の接着能亢進により、マトリゲルinvasion assayでも運動・浸潤能は低下した。[まとめ]以上の成績より、PPAR-γ核内受容体を標的にしたTZDによる膵癌治療は、癌細胞の分化誘導を介して膵癌細胞の増殖をcytostaticに抑制し、metastatic phenotypeを減弱させることから、tumor dormancyを誘導する有用な治療法になる可能性が示唆された。Peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ), a transcription factor belonging to the nuclearreceptor superfamily, forms functional heterodimers with the retinoid X receptor. Synthetic PPAR-γ ligands have been shown to inhibit the growth of several human tumor cell lines and to induce growth arrest and differentiation in primary cultures of human liposarcoma, colon cancer, and breast cancer cells in vitro and in vivo. The aim of this study was to examine whether PPAR-γ is expressed at high level in human pancreatic cancer cells, and its ligand can inhibit cellular growth through terminal differentiation of pancreatic cancer cells. In addition, we also examined whether thiazol idinedione (TZD), a potent PPAR-γ ligand. could modulate the E-cadherin/β-catenin system in human pancreatic cancer cells. First, in this study we investigated the expression of PPAR-γ in five pancreatic cancer cell lines: Capan-1(well differentiated adenocarcinema), AsPC-1(moderately differentiated adeno carcinoma), BxPC-3(moderately differentiated adenocarcinoma), Panc-1(poorly differentiated adenocarcinoma), and MIAPaCa-2(undifferentiated carcinoma). All five expressed PPAR-γ mRNA and protein, shown respectively on RT-PCR and Western blotting analisis. Clonogenic assaya showed that TZD completely inhibits colony formation of these cells at a concentration of 10 μ M. Moreover, treatment of these cells with 10 μM TZD resulted in GO/G1 cell cyclearrest. According to Western blotting, TZD markedly increased differentiation markers including E-cadherin and CEA, while β-catenin did not change significantly. In untreated cells, fluorescence immunostaining demonstrated β-catenin predominantly in the cytoplasm and/or nucleus: in TZD-treated cells, β-caten in localization had dramatically shifted to the plasma membrane, in association with increased E-cadherin at this site. Thus, a PPAR-γ ligand appears to participate not only in induction of cell growth and differentiation in pancreatic cancer cells, but also in the regulation of E-cadherin/β-catenin system. Such ligands may prove clinically useful as cytostatic anticancer agents.研究課題/領域番号:12671213, 研究期間(年度):2000-2002出典：「PPAR-γ核内受容体分子を標的にした新しい膵癌治療」研究成果報告書　課題番号12671213 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

Synthesis of 2-Aminofurans by Sequential [2+2] Cycloaddition-Nucleophilic Addition of 2-Propyn-1-ols with Tetracyanoethylene and Amine-Induced Transformation into 6-Aminopentafulvenes

Synthesis of 2-aminofuran derivatives with an azulene or N,N-dimethylanilino substituent was established by the formal [2+2] cycloaddition-retroelectrocyclization of 3-(1-azulenyl or N,N-dimethylanilino)-2-propyn-1-ols with tetracyanoethylene, followed by intramolecular nucleophilic addition to the initially formed tetracyanobutadiene moiety of the internal hydroxyl group that come from 2-propyn-1-ol. The reaction proceeds under mild conditions with short reaction period. The products of the reaction are readily available through a simple purification procedure. 2-Aminofuran derivatives obtained by this reaction could be converted into 6-aminofulvene derivatives upon reaction with various amines. The structures of 2-aminofuran and 6-aminopentafulvene with a N,N-dimethylanilino substituent were confirmed by single-crystal X-ray structural analysis.ArticleCHEMISTRY-A EUROPEAN JOURNAL. 23(21):5126-5136 (2017)journal articl

Synthesis of azulene-substituted benzofurans and isocoumarins via intramolecular cyclization of 1-ethynylazulenes, and their structural and optical properties

First published: 08 Dec 2017The preparation of azulene-substituted benzofurans and isocoumarins was established by two types of intramolecular cyclization reaction of 1-ethynylazulenes. 2-(1-Azulenyl)- and 2,3-bis(1-azulenyl)benzofurans were prepared by the palladium-catalyzed cross-coupling reaction of 1-iodoazulenes with 2-ethynylphenol and that of 1-ethynylazulenes with 2-iodophenol under Sonogashira-Hagihara reaction conditions following the intramolecular nucleophilic addition of the oxygen nucleophile to the presumed 1-arylethynylazulenes. In contrast, 1-(phenylethynyl)azulenes bearing an o-methoxycarbonyl function on the substituted phenyl moiety exhibited intramolecular cyclization either in the presence of trifluoroacetic acid or N-iodosuccinimide (NIS) to afford azulene-substituted isocoumarins and 4-iodoisocoumarins, and the structures were clarified by single-crystal X-ray analysis. The optical properties of these compounds were also investigated by UV/vis spectroscopy and theoretical calculations.ArticleORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY. 16(3):480-489 (2018)journal articl