放線菌を宿主とする新しいタンパク質発現系開発と応用

金沢大学理工研究域放線菌は土壌中に広く存在し、特徴的な菌糸形態を有するグラム陽性の原核生物であり、抗生物質をはじめとする多種多様な二次代謝物を生産する。当研究室では放線菌-大腸菌シャトルベクターであるpUC702にStreptoverticillium cinnamoneum由来分泌性タンパク質Phospholipase D(PLD)の遺伝子および、その上流プロモーター領域と下流ターミネター領域を導入pUc702-promoter-PLDを構築し、Streptomyces lividansに組換えを施すことで、野生株に対し、約20倍のPLDの分泌生産を示した^。本研究では、効率的なタンパク質生産やタンパク質の表層提示発現を目的として、本遺伝子組換え発現系の分泌生産に関与している分泌シグナル領域に様々な変異を導入しその発現挙動について解析を行った。また、放線菌由来の膜タンパク質をアンカーとしてPLDと融合発現させ放線菌におけるタンパク質の表層発現系の構築、Phospholipase A2(PLA2)などの有用タンパク質とPLDとの融合タンパク質発現系を構築した。その結果、以下の点について明らかとなった。1)放線菌ではGly-Xxx-Glyもシグナルペプチダーゼが認識してシグナルは切断される。2)PLD由来シグナルペプチドは疎水性が強くなることでタンパク質の生産性が向上することが明らかとなった。3)放線菌におけるPLD-PLA2融合タンパク質発現系を構築できた。また、codon usageが適切でないとタンパク質の合成は中断してしまう。研究課題/領域番号:18760591, 研究期間(年度):2006 – 2007出典：「放線菌を宿主とする新しいタンパク質発現系開発と応用」研究成果報告書　課題番号18760591（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-18760591/)を加工して作

DNAアプタマーによる生体ストレスマーカー分子検出系の開発

金沢大学大学院自然科学研究科8-hydroxy-2\u27-deoxyguanosine (8-OHdG)はDNAの構成成分である2\u27-deoxyguanosine (dG)が酸化されることにより生成される物質である。8-OHdGが生成するとDNA→RNAが発現する等生体に悪影響を及ぼすため生体は損傷したDNAを修復する機構をもっており、修復過程の結果、8-OHdGは正常なdGに置き換えられ、血中に排出される。8-OHdGは、比較的安定な物質であり、体内で分解されることなく、最終的に尿中に排出される。このように、尿中に存在する8-OHdGは生体内での酸化ストレスと密接に関係している。従って、尿中の8-OHdGの存在量を測定することは、生体がどの程度酸化ストレスにさらされているか、ひいては老化の程度、疾病の有無等を間接的に評価することにつながる。現在、この8-OHdGは免疫学的測定法を用いて測定することが可能である。しかしこの測定素子である抗体は熱、pHに対し不安定な性質を持ち、測定環境には制約がある。そこで本研究室では8-OHdGの測定素子として生体材料であるDNAアプタマーを用いる方法に注目した。DNAアプタマーは特定の分子と結合できる一本鎖のDNAの総称である。一般にDNAは生体内では二本鎖で存在し二重らせん構造を形成するが、一本鎖のDNAは様々な高次構造を形成することが知られており、この高次構造の様々な立体構造が分子との結合に関与していると考えられている。DNAアプタマーは、その分子の性質上、環境変化に安定であり、大量合成も容易である。これらの性質は熱、pHに不安定な抗体や酵素などのタンパク質と比較して有利である。本研究では8-OHdGを認識するDNAアプタマーの選抜とその機能評価、及びバイオセンサーのセンサ素子への応用を目的とし研究を行っている。これまでに我々は8-OHdGを認識するDNAアプタマーの選抜に成功し、その配列を特定した。そこで本研究では特定された配列について、BLACORE、蛍光偏光法及び限外ろ過の原理を用いて機能評価を行った。その結果、Sequence Qと命名した配列に8-OHdGに対して強い親和力を示すデータが得られた。またSequence Qについて8-OHdGと構造が類似したdGに対しては結合を示すデータは得られなかった。このことからSequence Qの8-OHdGに対する親和性は特異的なものであると考えられる。さらにCDスペクトル解析を用いてSequence Qの構造解析を試みたがG-カルテット構造を示すようなスペクトルは得られなかった。研究課題/領域番号:18038016, 研究期間(年度):2006出典：「DNAアプタマーによる生体ストレスマーカー分子検出系の開発」研究成果報告書　課題番号18038016（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-18038016/)を加工して作

リン脂質代謝酵素によるリン脂質の機能性改質とその医工学分野への適用検討

金沢大学理工研究域天然には微量であるが生体に様々な作用を示すリン脂質が多く発見され、人体において特定の臓器や部位を特異的に認識し、機能を示す事も明らかとされてきている。リン脂質は試験管内にて人工細胞に似た小胞(リポソーム)を構築することが出来る。リポソームは生体内で生細胞と融合することが可能であり、細胞と同じ成分より構築されているため免疫系を活性化させない利点を有している。この性質を利用して、リポソームを運搬体とした人体への遺伝子導入技術の開発が行われている。しかし、現行リポソームを用いた遺伝子導入技術は、遺伝子導入を行いたい特定臓器の認識機能を有していない。この原因は、分子認識を行うリン脂質を合成することが非常に困難であり、化学触媒・酵素のどちらを用いても現在までその有用な作成法が確立されていないことにある。現在までにリン脂質の特性を変換する酵素(ホスホリパーゼD:PLD)を微生物より2種同定し、その遺伝子配列の同定、反応特性解析を行ってきた。そしてこのPLD酵素を発現させるために、大腸菌と放線菌系での発現系を構築してきた。更に、種々のアミノ酸残基に変異を導入した変異型PLDを用いた解析より、野生型と比較して約10倍の高い活性を有している機能的な酵素の創成に成功している。この変異体PLDは野生型と比較して高活性を示す以外に、基質特異性の変化も確認され、新しいリン脂質の合成に際して、効果的な触媒として作用する事が期待される。以上の研究背景より、本研究では認識分子を持ったリン脂質(リポソーム表面に局在)を、PLDを用いて効率的に合成できる酵素反応プロセスを構築し、更に合成した機能性リン脂質の機能評価を行う事を目的とする。そして、今後需要が見込まれる遺伝子治療・再生医工学分野への応用を考え、生体において部位特異的な認識を行う機能性リポソーム(遺伝子導入用リポソーム)の合成プロセス確立と生細胞を用いた細胞認識の評価についても行う。本年度は昨年度作製した変異型PLD酵素を用いてリン脂質合成を検討した。現在までは一般的なリン脂質の基質としてエタノール分子を用いてきたが、今回、エタノールアミンやセリン分子を基質として用いた場合、変異体により異なる酵素特性を有していることが明らかとなった。この結果は、触媒反応と基質認識性の間に立体的な相関関係が存在することを示唆している。研究課題/領域番号:14750634, 研究期間(年度):2002-2003出典：「リン脂質代謝酵素によるリン脂質の機能性改質とその医工学分野への適用検討」研究成果報告書　課題番号14750634（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-14750634/)を加工して作

機能性リン脂質の酵素合成におけるイオン性液体添加効果の解析

金沢大学大学院自然科学研究科リパーゼ類のイオン液体中での酵素反応報告は多くなされているが、リン脂質代謝酵素に関しては報告例が全くなかった。そこでまず、PLD酵素がイオン液体中で安定して存在するか、8種のイオン液体を用いて検討を行った。各イオン液体と酵素溶液)in 20mM Tris-HCl)pH 7.4)をそれぞれ重量比で50%になるように混合し、30度にて3日間、攪拌および保温した。その結果、初日のPLD活性を100%とし比較を行った結果、何も加えない系では1日の加温にてPLD活性は約25%まで減少するのに比較して、BminPF6およびTMPATFSIと接触させた系では、3日間の接触によっても100%の酵素活性を維持していることが明らかとなった。接触させることで酵素活性が対照実験と比較して減少する系もあることから、両者のイオン液体はPLD酵素の安定性に寄与している可能性が高い。イオン液体中でのPLD酵素の安定性が確認できたので、次にこれまでのPLD酵素では酵素失活が激しいために顕著な反応生成物が確認できなかった、水相・n-ヘキサン系へのイオン液体の添加効果)酵素安定性向上効果)を検討した。その結果、アニオンがTFSI系のイオン液体では、対照実験と比較して約2倍の酵素安定性が確認できた。また、リン脂質はイオン液体には溶解しないと事前実験より確認していたが、OminBF4系では長期に静値することでリン脂質が溶解することも確認できた。研究課題/領域番号:18045016, 研究期間(年度):2006 – 2007出典：「機能性リン脂質の酵素合成におけるイオン性液体添加効果の解析」研究成果報告書　課題番号18045016（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-18045016/)を加工して作

バイオターゲティング素子合成に適した活性制御型ホスホリパーゼDの創製

金沢大学理工研究域昨年の研究報告により、ヒスチジン(H)、リジン(K)、アスパラギン酸(D)から構成されるその保存領域はHKDモチーフ(HxKxxxD)と呼ばれ、PLD酵素活性には必須であることが明らかとなっている。またそれぞれのHKDモチーフの下流にはグリシン・グリシン(GG)モチーフとグリシン・セリン(GS)モチーフが存在することも明らかとなっている。本年度はHKDモチーフとGG-GSモチーフに関して部位特異的アミノ酸置換を行い、触媒機能変換に関して解析を行う。最後にタンパク質立体構造予測ソフトを用い、野生型PLD酵素と変異導入PLD酵素の立体構造変化について予測を行い、触媒作用の変化と立体構造変化の相関関係について解析および考察を行う。点変異導入による部位特異的アミノ酸導入の影響の解析から、触媒活性においてHKDモチーフ内のヒスチジン、リジン、アスパラギン酸残基は必須であることが明らかとなった。また、GG-GSモチーフに変異を導入したところ、いくつかの変異体に関してリン酸基転移反応活性が野生型と比較して10倍以上に向上した。これらの変異体については今後立体構造を実際に結晶解析を行って検討しなければならないが、現段階ではGG-GSモチーフに変異を導入することで何らかの触媒作用変化がおきたものと考えられる。さらに、486番目のチロシンに変異を導入したところ、HKDモチーフ同様活性が1/3以下に減少したことから、このチロシン残基もリン酸基転移反応活性に重要な影響を及ぼしているということがあきらかになった。また触媒活性が向上したGG-GSモチーフ変異体について、タンパク質立体構造予測ソフトを使用して立体構造を解析したところ、GG-GSモチーフに変異を導入することによりある特定の構造変化を示す1つのループ構造が確認された。このことから変異導入によるループ構造の変化が、触媒活性に影響を及ぼしているものだと考えられる。研究課題/領域番号:12750699, 研究期間(年度):2000-2001出典：「バイオターゲティング素子合成に適した活性制御型ホスホリパーゼDの創製」研究成果報告書　課題番号 12750699（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12750699/)を加工して作

A display of pH-sensitive fusogenic GALA peptide facilitates endosomal escape from a Bio-nanocapsule via an endocytic uptake pathway

BACKGROUND: An affibody-displaying bio-nanocapsule (Z(HER2)-BNC) with a hepatocyte specificity derived from hepatitis B virus (HBV) was converted into an affibody, Z(HER2), that recognizes HER2 receptors. This affibody was previously reported to be the result of the endocytosis-dependent specific uptake of proteins and siRNA into target cancer cells. To assist the endosomal escape of inclusions, a helper lipid with pH-sensitive fusogenic ability (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phos phoethanolamine; DOPE) was conjugated with a Z(HER2)-BNC. FINDINGS: In this study, we displayed a pH-sensitive fusogenic GALA peptide on the surface of a particle in order to confer the ability of endosomal escape to a Z(HER2)-BNC. A GALA-displaying Z(HER2)-BNC purified from yeast uneventfully formed a particle structure. Furthermore, endosomal escape of the particle was facilitated after endocytic uptake and release of the inclusions to the cytoplasm without the cell toxicity. CONCLUSION: The genetic fusion of a GALA peptide to the virus-like particle confers the ability of endosomal escape

Direct ethanol production from cellulosic materials using a diploid strain of Saccharomyces cerevisiae with optimized cellulase expression

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Hydrolysis of cellulose requires the action of the cellulolytic enzymes endoglucanase, cellobiohydrolase and β-glucosidase. The expression ratios and synergetic effects of these enzymes significantly influence the extent and specific rate of cellulose degradation. In this study, using our previously developed method to optimize cellulase-expression levels in yeast, we constructed a diploid <it>Saccharomyces cerevisiae </it>strain optimized for expression of cellulolytic enzymes, and attempted to improve the cellulose-degradation activity and enable direct ethanol production from rice straw, one of the most abundant sources of lignocellulosic biomass.</p> <p>Results</p> <p>The engineered diploid strain, which contained multiple copies of three cellulase genes integrated into its genome, was precultured in molasses medium (381.4 mU/g wet cell), and displayed approximately six-fold higher phosphoric acid swollen cellulose (PASC) degradation activity than the parent haploid strain (63.5 mU/g wet cell). When used to ferment PASC, the diploid strain produced 7.6 g/l ethanol in 72 hours, with an ethanol yield that achieved 75% of the theoretical value, and also produced 7.5 g/l ethanol from pretreated rice straw in 72 hours.</p> <p>Conclusions</p> <p>We have developed diploid yeast strain optimized for expression of cellulolytic enzymes, which is capable of directly fermenting from cellulosic materials. Although this is a proof-of-concept study, it is to our knowledge, the first report of ethanol production from agricultural waste biomass using cellulolytic enzyme-expressing yeast without the addition of exogenous enzymes. Our results suggest that combining multigene expression optimization and diploidization in yeast is a promising approach for enhancing ethanol production from various types of lignocellulosic biomass.</p

Targeting cancer cell-specific RNA interference by siRNA delivery using a complex carrier of affibody-displaying bio-nanocapsules and liposomes

BACKGROUND: Small interfering RNA (siRNA) has attracted attention in the field of nucleic acid medicine as a RNA interference (RNAi) application that leads to gene silencing due to specific messenger RNA (mRNA) destruction. However, since siRNA is unstable in blood and unable to cross the cell membrane, encapsulation of siRNA into a carrier is required. RESULTS: In this study, we used a carrier that combined Z(HER2)-displaying bio-nanocapsule (derived from hepatitis B virus surface antigen) and liposomes in a complex in order to investigate the feasibility of effective and target-cell-specific RNAi applications. As a result, by observing RNAi only in HER2-expressing breast cancer cells, using our proposed methodology, we successfully demonstrated target-cell-specific delivery and effective function expression of siRNA. CONCLUSIONS: These findings show that, in the field of nucleic acid medicine, Z(HER2)-BNC/LP can be a useful carrier for siRNA delivery, and could also become a useful tool for gene silencing and to accomplish protein knock-down

Cocktail δ-integration: a novel method to construct cellulolytic enzyme expression ratio-optimized yeast strains

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The filamentous fungus <it>T. reesei </it>effectively degrades cellulose and is known to produce various cellulolytic enzymes such as β-glucosidase, endoglucanase, and cellobiohydrolase. The expression levels of each cellulase are controlled simultaneously, and their ratios and synergetic effects are important for effective cellulose degradation. However, in recombinant <it>Saccharomyces cerevisiae</it>, it is difficult to simultaneously control many different enzymes. To construct engineered yeast with efficient cellulose degradation, we developed a simple method to optimize cellulase expression levels, named cocktail δ-integration.</p> <p>Results</p> <p>In cocktail δ-integration, several kinds of cellulase expression cassettes are integrated into yeast chromosomes simultaneously in one step, and strains with high cellulolytic activity (i.e., expressing an optimum ratio of cellulases) are easily obtained. Although the total integrated gene copy numbers of cocktail δ-integrant strain was about half that of a conventional δ-integrant strain, the phosphoric acid swollen cellulose (PASC) degradation activity (64.9 mU/g-wet cell) was higher than that of a conventional strain (57.6 mU/g-wet cell). This suggests that optimization of the cellulase expression ratio improves PASC degradation activity more so than overexpression.</p> <p>Conclusions</p> <p>To our knowledge, this is the first report on the expression of cellulase genes by δ-integration and optimization of various foreign genes by δ-integration in yeast. This method should be very effective and easily applied for other multi-enzymatic systems using recombinant yeast.</p