Biophysical and biochemical characterization of a liposarcoma-derived recombinant MnSOD protein acting as an anticancer agent

A recombinant MnSOD (rMnSOD) synthesized by specific cDNA clones derived from a liposarcoma cell line was shown to have the same sequence as the wild-type MnSOD expressed in the human myeloid leukaemia cell line U937, except for the presence of the leader peptide at the N-terminus. These results were fully confirmed by the molecular mass of rMnSOD as evaluated by ES/MS analysis (26662.7 Da) and the nucleotide sequence of the MnSOD cDNA. The role of the leader peptide in rMnSOD was investigated using a fluorescent and/or 68Gallium-labelled synthetic peptide. The labelled peptide permeated MCF-7 cells and uptake could be inhibited in the presence of an excess of oestrogen. In vivo it was taken up by the tumour, suggesting that the molecule can be used for both therapy and diagnosis. The in vitro and in vivo pharmacology tests confirmed that rMnSOD is only oncotoxic for tumour cells expressing oestrogen receptors. Pharmacokinetic studies in animals performed with 125I- and 131I-labelled proteins confirmed that, when administered systemically, rMnSOD selectively reached the tumour, where its presence was unambiguously demonstrated by scintigraphic and PET scans. PCR analysis revealed that Bax gene expression was increased and the Bcl2 gene was down regulated in MCF7 cells treated with rMnSOD, which suggests that the protein induces a pro-apoptotic mechanism

La cellula staminale emopoietica nell’organo di Leydig durante la vita embrionale di Torpedo marmorata Risso: indagine immunocitochimica

Negli Elasmobranchi, privi di midollo osseo emopoietico, il tessuto linfomieloide è sede di granulocitopoiesi ed in piccola parte di linfocitopoiesi. Allo scopo di evidenziare la comparsa della cellula staminale emopoietica (HSC) durante l’embriogenesi degli organi emopoietici delle torpedini, è stata effettuata un’indagine immunocitochimica sul tessuto linfomieloide esofageo (organo di Leydig), in tre diversi stadi di sviluppo di Torpedo marmorata Risso. A tal fine, sono state allestite sezioni istologiche di embrione (per i primi due stadi) e di esofago isolato (per il terzo stadio) trattate con metodo di doppia marcatura, con anticorpo monoclonale anti-CD34, rivelato dal Silver Enhancing e con anticorpo policlonale anti-CD38, rivelato dalla fosfatasi alcalina (ALP). I risultati ottenuti hanno evidenziato nei primi due stadi solo alcune cellule simil-linfoidi negative alla immunomarcatura e, nell’embrione a termine (III stadio), la presenza di quattro popolazioni cellulari: CD34+/CD38-, CD34+/CD38+, CD34-/CD38+ e CD34-/CD38-. È stato osservato, inoltre, un “gradiente” di immunoreattività al CD34, decrescente con la maturazione e la comparsa della immunoreattività al CD38, negli stadi commissionati per la linea leucocitaria, così come noto nei Mammiferi. Pertanto, la comparsa della cellula staminale emopoietica nel tessuto linfomieloide sembra abbastanza tardiva nel corso dell’embriogenesi di torpedine e si può supporre che l’espressione dei markers di staminalità nelle cellule progenitrici emopoietiche si sia conservata lungo la scala evolutiva

Indagine citochimica ed immunocitochimica per il riconoscimento della leucocitosi eterofila nella tartaruga marina Caretta caretta

Gli eterofili sono stati identificati sulla base delle positività a: PAS, MPO, ALP (Fig. 3; 4; 5); mentre gli eosinofili per la positività alla CAE, MBP ed alla IL5 (Fig. 6; 7; 9). La MBP e la IL5 visualizzate anche in microscopia elettronica (Fig. 8 ;10) sono state localizzate all’interno dei granuli a core paracristalloide (Fig 11) in conformità a quanto noto per i granulociti eosinofili dei Mammiferi. Tale positività non risulta tuttavia legata in modo esclusivo al core paracristalloide, essendo rilevabile anche in granuli privi di quest’ultimo ma contenuti sempre nelle stesse cellule. Dallo studio eseguito è risultato che negli esemplari di caretta esaminati, è più frequente la granulocitosi eterofila. Tale patologia è collegabile ad infezioni batteriche che sono state risolte con terapia antibiotica appropriata

ERITROPOIESI CIRCOLANTE NELLA TARTARUGA MARINA CARETTA CARETTA: STUDIO IMMUNOCITOCHIMICO DI MOLECOLE ANTIAPOPTOTICHE

L'omeostasi dell'eritrone, nei Mammiferi, viene regolata dai fenomeni apoptotici. Nei Rettili marini nei quali, a differenza dei Mammiferi, l’eritrocita maturo è una cellula completa di tutti gli organuli e l’eritropoiesi si completa in circolo, lo studio del meccanismo apoptotico di regolazione dell’emopoiesi trova un valido modello di studio. Un ruolo importante nell'apoptosi è esplicato dai membri della famiglia delle Bcl-2; in particolare le proteine Bcl-2 e Bcl-xl sono note nei Mammiferi quali inibitori di tale processo. L'espressione di tali molecole è stata studiata con metodi immunocitochimici, al TEM, nelle cellule eritroidi circolanti della tartaruga marina Caretta caretta, allo scopo di rivelarne la localizzazione ultrastrutturale negli stadi maturativi di eritroblasto basofilo, eritroblasto acidofilo ed eritrocita maturo presenti nel sangue circolante. A tal fine, sono state allestite sezioni ultrafini di cellule del sangue, immunomarcate con anticorpi policlonali Bcl-2 e Bcl-xl (Santa Cruz, 1:20) e rivelate con anticorpo secondario coniugato con oro colloidale da 10nm (Sigma, 1: 40). Con tale metodo è stata rivelata un'intensa espressione di Bcl-2 e Bcl-xl nell'eritroblasto basofilo, una debole espressione in quello acidofilo ed una scarsa, o assente espressione nell'eritrocita maturo. Tali molecole sono state osservate oltre che nei mitocondri, principali organelli coinvolti nell'apoptosi, anche nel reticolo endoplasmatico ed in piccola quantità nel nucleo degli stadi più immaturi. Questi dati confermano il coinvolgimento di tali proteine anti-apoptotiche nella maturazione delle cellule eritroidi anche nelle tartarughe marine

Emoglobina instabile nella tartaruga marina Caretta caretta

L'indagine elettroforetica della emoglobina di esemplari di caretta caretta ha rivelato la presenza di tre frazioni di emoglobina instabile

Ultrastructural immunolocalization of transferrin receptor in circulating erythroid cells: its role as biomarker for X ray damage in Elasmobranchs

Transferrin receptor (CD71), a membrane glycoprotein involved in iron absorption, that plays a key role in metabolism and cell homeostasis, is a biomarker of X-ray damage in man and rat(1). Following previous observations by FACS and immunocytochemical detection at L.M., that suggested an increased CD71 expression in the circulating erythroid cells (RBCs) of Torpedoes after X-ray exposure, the aim of this study was the ultrastructural localization of this marker before and after X-ray treatment of benthonic Elasmobranchs (Torpedo marmorata and Torpedo ocellata) in order to evaluate whether CD71 can be used as a biomarker of sea X-ray pollution. Ultrathin sections of RBCs, withdrawn from 3 specimens before and after irradiation (45, 80 and 90 Gy), were first incubated with polyclonal primary antibody anti-CD71, then with secondary antibody conjugated with colloidal gold and lastly contrasted and observed by T.E.M.. Before irradiation, only few RBCs showed low CD71-immunoreactivity, mainly in plasma membrane but also cytoplasm. After irradiation, morphological apoptotic-like changes in the nucleus and cytoplasm vacuolization were observed and a more intense CD71-ir was found mainly into cytoplasmic vesicles, demonstrating an increased receptor endocytosis and occasionally in mitochondria, injured by irradiation. These preliminary data, showing an increased CD71 expression and internalization in circulating RBCs of Torpedoes after X-ray exposure, may suggest, if confirmed by further experiments, the role of CD71 as biomarker of X-ray sea pollution

MBP and IL 5 as markers of eosinophilic granulocytes in circulating blood of the sea turtle Caretta caretta

Eosinophils play a key role in defense against parasites and serve as an important mediator cell in hypersensitivity diseases. Eosinophils of the sea turtles are, generally, rare in the differential count (about 4%) and contain both eosinophilic and colourless granules in their cytoplasm. They were studied by immunocytochemical detection of major basic protein(MBP) and interleukin-5 (IL5) at L.M and TEM in leukocytes of 6 specimens of Caretta caretta. It is well known in Mammals that MBP is a potent enzyme against helminths and is toxic towards bacteria. It activates neutrophils and macrophages, and is implicated in asthma. It forms the electron-dense crystalline core of the specific granules of mature peripheral blood eosinophils (Swaminathan et al., 2005). IL5 is a growth and differentiation factor (Clutterbuck et al, 1989), activator and chemoattractant for eosinophils and, as a consequence, is considered a pivotal cytokine in allergen-mediated eosinophilic responses. Both blood smears and ultrathin sections of the buffy coat were treated with anti-MBP and anti IL5 polyclonal antibodies revealed by ABC method on the smears and by immunogold method for TEM. At LM both MBP and IL5 immunoreactivities were localized in the cytoplasmic granules. IL5 was detected in the cytoplasm of the lymphocytes too. These results were confirmed by TEM observations by showing an intense gold labelling of MBP in the granules, even if most of them are lacking of crystalloid core. IL5 detection displayed less intense immuno- reactivity in the eosinophilic granules and in the lymphocyte

Active Internalization of a Mn-SOD in living tumor cells

MnSOD deserve not only to be considered for the treatment cancer but also to prevent or to restore the degeneration of normal cells, having atherapeutic potential against other pathological conditions known to be associated with oxidative stresses, such as neurodegenerative diseases and agin

Screening ematologico delle tartarughe marine del Mediterraneo: determinazione dei parametri di normalità dell’emocromo in Caretta caretta

La valutazione dello stato di salute degli esemplari di tartaruga marina Caretta caretta, specie a rischio di estinzione, risulta problematica data l’assenza di valori ematologici di riferimento, in particolare per la popolazione del Mediterraneo, sostanzialmente isolata dalle conspecifiche di altri mari. L’emocromo è stato eseguito su campioni di sangue prelevati dal seno venoso cervicale di 22 esemplari, di recente cattura e apparentemente in buono stato di salute; i valori ematologici sono stati utilizzati per stabilire gli intervalli di normalità dei singoli parametri, da usare quale riferimento per la valutazione degli esemplari che pervengono presso il Centro di recupero della Stazione Zoologica in condizioni di grave debilitazione. Per gli esemplari giovani, di peso compreso tra 0,68 e 10,00 kg, i valori medi determinati sono: WBC 23.800/µL, RBC 488.000/µL, concentrazione emoglobinica (Hgb) pari a 8,0 g/dL, ematocrito (Ht) 23%, MCV 487 fL, MCH 170 pg, MCHC 35%. Per gli esemplari adulti, di peso compreso tra 10,00 e 26,00 kg, i valori medi sono: WBC 22.800/µL, RBC 411.000/µL, Hgb 10,6 g/dL, Ht 29%, MCV 725 fL, MCH 261 pg, MCHC 36%. Il presente studio, unitamente a quello condotto dallo stesso gruppo di ricerca sui principali parametri ematochimici, fornisce un nuovo, indispensabile strumento per il monitoraggio ematologico e la salvaguardia della tartaruga marina Caretta caretta