Усиление сигнала SPR биосенсора с помощью золотых наночастиц на примере анализа бета-2-микроглобулина человека

The highly sensitive method of surface plasmon resonance (SPR) detection of low concentrations of target proteins based on the biosensor signal enhancement by using gold nanoparticles (similar to “sandwich” assay type) is described. The commercial protein preparations of beta-2-microglobulin (B2M) as a model biomarker and polyclonal (Pab) and monoclonal antibodies (Mab) to B2M were used. It has been shown that this universal and reproducible method can be applied for SPR analysis of other protein biomarkers by analogy with the biomarker protein B2M. The present work is also focused on the experimental protocol description. The protocols of gold nanoparticles (GNP) synthesis, obtaining the conjugates of Pab/GNP and measuring their concentration, the protocol of Mab covalent immobilization on the optical chip CM5 of a biosensor and also SPR registration of molecular interactions Mab-biomarker and in the “sandwich” assay type Mab-biomarker-Pab or Mab-biomarker-Pab/GNP are considered in detail.Описан высокочувствительный метод детекции низких концентраций целевых белков с помощью усиления сигнала оптического биосенсора на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием золотых наночастиц (по типу “сандвич”). В качестве модели биомаркера использован коммерческий белковый препарат бета-2-микроглобулина (B2M), а также препараты поликлональных (Pab) и моноклональных антител (Mab) к B2M. Данный метод анализа вследствие его универсальности и воспроизводимости может быть применён для анализа любых белковых биомаркеров. Подробно рассмотрены экспериментальные протоколы синтеза золотых наночастиц (GNP), получения их конъюгатов с поликлональными антителами (Pab/GNP), спектрофотометрического определения концентрации наночастиц и конъюгатов, ковалентной иммобилизации Mab на поверхности оптического чипа СМ5 биосенсора, регистрации взаимодействий Mab-биомаркер и формирования типа “сандвич” Mab-биомаркер-Pab и Mab-биомаркер-Pab/GNP

Additive N-Step Markov Chains as Prototype Model of Symbolic Stochastic Dynamical Systems with Long-Range Correlations

A theory of symbolic dynamic systems with long-range correlations based on the consideration of the binary N-step Markov chains developed earlier in Phys. Rev. Lett. 90, 110601 (2003) is generalized to the biased case (non equal numbers of zeros and unities in the chain). In the model, the conditional probability that the i-th symbol in the chain equals zero (or unity) is a linear function of the number of unities (zeros) among the preceding N symbols. The correlation and distribution functions as well as the variance of number of symbols in the words of arbitrary length L are obtained analytically and verified by numerical simulations. A self-similarity of the studied stochastic process is revealed and the similarity group transformation of the chain parameters is presented. The diffusion Fokker-Planck equation governing the distribution function of the L-words is explored. If the persistent correlations are not extremely strong, the distribution function is shown to be the Gaussian with the variance being nonlinearly dependent on L. An equation connecting the memory and correlation function of the additive Markov chain is presented. This equation allows reconstructing a memory function using a correlation function of the system. Effectiveness and robustness of the proposed method is demonstrated by simple model examples. Memory functions of concrete coarse-grained literary texts are found and their universal power-law behavior at long distances is revealed.Comment: 19 pages, 8 figure

Высокопроизводительный скрининг с помощью оптического SPR-биосенсора низкомолекулярных соединений на взаимодействие с CYP51 Candida krusei

The opportunistic fungus Candida krusei is the causative agent of nosocomial infections characterized by high mortality and development of resistance to drugs of the azole class. Therefore, develjoment of non-azole antifungal agents against resistant fungal strains is extremly important. Lanosterol 14-alpha demethylase (CYP51) is a well-known antifungal target. The optical SPR biosensor is a universal tool for screening studies in search of new drug prototypes. This paper presents the methodological aspects of high-hroughput SPR based screening of a library of low molecular weight compounds of natural origin for their interaction with C. krusei CYP51. It has been shown that when performing high-throughput screening, a researcher should pay special attention to the degree of a sensorgram curvature in the association phase. The described approaches to the analysis of high throughput screening data can be useful for researchers working with SPR biosensors from various manufacturers.Условно-патогенный гриб Candida krusei (C. krusei) является возбудителем нозокомиальных инфекций, характеризующихся высокой летальностью. В последнее время наблюдается тенденция к увеличению доли штаммов дрожжевых грибов, резистентных к препаратам класса азолов. Поэтому поиск потенциальных противогрибковых соединений неазольной природы является актуальным направлением исследований при разработке новых эффективных терапевтических средств в отношении резистентных штаммов грибов. Ланостерол 14-альфа деметилаза (CYP51) является широко известной мишенью для противогрибковых средств. Оптические SPR-биосенсоры представляют собой универсальный инструмент для скрининговых исследований, целью которых является поиск прототипов новых лекарственных соединений. В данной работе представлены методические аспекты высокопроизводительного скрининга библиотеки низкомолекулярных соединений природного происхождения, направленного на установление их взаимодействия с CYP51 C. krusei с использованием SPR-биосенсора. Как показывают результаты, при проведении высокопроизводительного скрининга особое внимание следует обращать на степень выраженности наклона сенсограммы взаимодействия в фазе ассоциации. Описанные подходы к анализу данных высокопроизводительного скрининга могут быть полезны исследователям, работающим с SPR-биосенсорами различных моделей

Особенности пробоподготовки лизатов для повышения эффективности выделения белковых партнеров целевых белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека

The aim of this work was to test modifications of the standard protocol for the sample preparation of cell/tissue lysate before performing the affinity isolation of lysate protein partners for the target protein (bait protein) which is covalently immobilized on an inert sorbent (e.g. BrCN-, SH-Sepharose 4B) or a carrier (e.g. paramagnetic nanoparticles). The series of our previous works on applying the approach to direct molecular fishing procedure with combination of affinity chromatography and LC-MS/MS analysis using a number of proteins, encoded by the genes of human chromosome 18, have shown that there are at least two problems affecting the specificity and the effectiveness of this procedure. These include: (i) redundancy of the background proteins in the eluates from an affinity sorbent (carrier) due to isolation of multiprotein complexes “labeled” with a direct protein partner which binds with a bait protein immobilized on the sorbent; (ii) low enrichment of the eluates with appropriate protein partners due to the fact that some direct protein partners in the lysate exist in stable “wild type” complexes with the bait protein itself. This means that latter group of protein partners will not be sufficiently isolated from lysate. Therefore, in order to increase the specificity and efficiency of affinity isolation of protein partners for the bait protein, we modified the standard protocol of lysate preparation and the preliminary step on dissociation of lysate protein complexes was added. Several model experiments for the choice of regeneration solution, assessment of their efficiency in the dissociation of lysate protein complexes as well as the stability and binding capacity of proteins were performed under the control of surface plasmon resonance (SPR) biosensor Biacore 3000 using HepG2 cell lysate. It was shown that acid treatment and incubation of the cell lysate for one min on ice (final lysate dilution 20 times) and subsequent neutralization (pH shift from 2.0 to 7.4) resulted in maximal dissociation of the lysate protein complexes without significant negative effects on the protein-protein interactions tested.Целью работы было экспериментальное тестирование модификации стандартного протокола пробоподготовки клеточного/ тканевого лизата перед выполнением процедуры аффинного выделения из него белков-партнеров для целевого белка (белка-наживки), иммобилизованного на инертном сорбенте или парамагнитных наночастицах. Цикл наших предыдущих работ, посвященных прямому молекулярному фишингу с сопряжением хроматографических и масс-спектрометрических методов и технологии парамагнитных наночастиц c использованием ряда белков 18-ой хромосомы человека и также других белков показал, что существуют, по крайне мере, две проблемы, влияющие на специфичность и эффективность данной процедуры: (i) избыточность фоновых белков в элюатах с аффинного сорбента, обусловленная выделением мультибелковых комплексов, меченых прямым партнером, который связывается с целевым белком на сорбенте; (ii) низкая обогащенность элюатов белками-партнерами целевой группы обусловленная тем, что та или иная часть прямых белков-партнеров в лизате находится в составе стабильных комплексов «дикого типа» с самим белком-наживкой и не будет в достаточной степени выделена из лизата. Поэтому для повышения специфичности и эффективности аффинного выделения белков-партнеров целевого белка нами предложена модификация стандартной пробоподготовки, заключающаяся в предварительной диссоциации белковых комплексов лизата. Модельные эксперименты по выбору регенерационного раствора, оценке стабильности и связывающей способности белков при его воздействии, а также оценка эффективности диссоциации комплексов в лизате были выполнены под контролем оптического биосенсора Biacore 3000 («GE Healthcare», США) с использованием лизата клеточной культуры гепатокарциномы человека (HepG2) и рекомбинантных препаратов белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека, Показано, что кислотная обработка разбавленного в 20 раз лизата с кратковременной экспозицией в течение 1 мин на льду и с последующей нейтрализацией (с рН 2.0 до рН 7.4) приводила к максимальной диссоциации белковых комплексов лизата, не оказывая существенного негативного влияния на тестируемые белок- белковые взаимодействия

Использование SPR биосенсора при поиске прототипов лекарственных средств на примере цитохрома Р450(51) в качестве белка-мишени

The development of the integral platform “From Gene to Lead”, consolidated computer methods, bioinformatics researches, and experimental approaches, significantly accelerated and optimized base structure search in the field of drug design. The necessity of the experimental verification of hundreds virtual structure hypothesis (results of molecular data base selections or de novo construction) requires demands the usage of the high-through out and sensitive methods for validation possible interaction between numerous of selected compounds and particular molecular targets and evaluation of affinity, kinetics and thermodynamics. Surface plasmon resonance (SPR) technology makes it possible to solve all these problems. In this article the methodical aspects of the optical SPR-biosensor usage in the field of drug prototypes selection are described using the human cytochrome P450(51) catalyzing one of the key step of cholesterol biosynthesis as an example.Интеграция различных компьютерных, биоинформатических и экспериментальных технологий в единую платформу, покрывающую путь “от гена до прототипа лекарства”, значительно ускорила и оптимизировала поиск базовых структур для создания новых лекарственных препаратов. При этом необходимость экспериментальной проверки найденных компьютерными методами сотен структурных гипотез, представляющих собой выборки из молекулярных баз данных или сконструированных de novo соединений, требует привлечения быстрых и чувствительных скрининговых методов анализа их возможных взаимодействий с белком-мишенью. А в случае позитивного результата и возможности количественной оценки аффинности, кинетики и термодинамики межмолекулярного взаимодействия. Технология поверхностного плазмонного резонанса (SPR) позволяет решать все перечисленные задачи. В данной статье рассматриваются методические аспекты применения оптического SPR биосенсора для поиска прототипов лекарственных средств на примере цитохрома Р450(51) человека, катализирующего ключевую стадию биосинтеза холестерина

Augmentative and Alternative Communication and Alleviating of the Behavioral Difficulties of Adolescents with Severe Multiple Developmental and Behavioral Disorders

This article is relevant in the framework of the study educational training importance and the ability to communicate with adolescents with severe multiple developmental and behavioral disorders (SMDD) in adults working for inpa- tient social service institution (ISSI). The survey of communication and behavioral skills in adolescents with SMDD living in ISSI presented. The study involved 60 employees, 28 adolescents with SMDD, 20 parents of special children. Methods used: Communication Matrix, cyclogram «Review of the day», evaluation sheet «Table of interests». A spe- cific case of employee training and introduction of Augmentative and Alternative Communication techniques into an individual form of work with the student and the impact of these activities on improving her behavior demonstrated. The experimental data presented in this article can be used for work with ISSI to increase the communication skills available to students with SMDD. Also, the article includes the description of the work on improvement of the qual- ity of life of adolescents with SMDD that are in inpatient institutional care. It has been established that children and adolescents with SMDD living in the ISSI have persistent impairments in mastering skills, identifying their com- munication mechanisms

Протеолипосомы как способ иммобилизации мембранных белков для SPR-анализа на примере взаимодействия CYP3A4 и CYB5A человека

Microsomal systems of human cytochrome P450 consist of three components, which are membrane proteins: cytochrome P450 hemoprotein (CYP), NADPH-dependent cytochrome P450 reductase (CPR), and a small regulatory heme-containing protein cytochrome b₅ (CYB5A). In the study of the cytochrome P450 system functioning the study of intermolecular interactions both with partner proteins and with possible drug prototypes is of great importance. Surface plasmon resonance (SPR) is a powerful and reliable tool for studying intermolecular interactions. However, there is a problem of immobilization of membrane proteins on the optical chip of the SPR biosensor. It is important to immobilize such proteins in native conditions with respect to the correct orientation of the protein globule to the surface of sensor. Previously, we have developed and described a method involving direct native immobilization of membrane proteins into a planar bilayer lipid membrane on the surface of a biosensor chip. At the same time, one of the commonly used approaches to working with membrane proteins using various methods is the construction of proteoliposomes containing membrane proteins. In this work, using CYP3A4 and CYB5A as protein partners, we evaluated two approaches to the creation of proteoliposomes: incorporation of a membrane protein into liposomes saturated with detergents and incorporation of a membrane protein into the forming proteoliposomes by the mechanism of micellar coalescence. The interaction of CYP3A4 with proteoliposomes obtained by incorporating CYB5A into detergent-saturated liposomes was shown. On the contrary, interaction between CYP3A4 and proteoliposomes containing CYB5A, obtained by the method of micellar coalescence, was not detected. Thus, it was shown that the incorporation of the membrane protein into liposomes saturated with a detergent was a more preferable method for working with an SPR biosensor as compared to the method of proteoliposomes formation by micellar coalescence. Detailed protocols for the creation of proteoliposomes and SPR-analysis can be useful to a wide range of researchers.Микросомальные системы цитохромов P450 человека состоят из трёх компонентов, являющихся мембранными белками: гемопротеина цитохрома P450 (CYP), NADPH-зависимой цитохром Р450 редуктазы (CPR) и небольшого регуляторного гем-содержащего белка цитохрома b₅ (CYB5A). Важным направлением в изучении системы цитохромов Р450 является исследование межмолекулярных взаимодействий как с белками-партнёрами, так и с возможными прототипами лекарств. Одним из передовых подходов к изучению межмолекулярных взаимодействий является использование метода поверхностного плазмонного резонанса (SPR). При этом возникает проблема иммобилизации мембранных белков на оптический чип SPR-биосенсора. Для моделирования нативных условий важное значение имеет соблюдение правильной ориентации белковой глобулы в пространстве. Ранее нами был разработан метод, предполагающий прямую иммобилизацию нативных мембранных белков в планарную бислойную липидную мембрану на поверхности чипа биосенсора. Другим широко распространённым подходом для работы с мембранными белками является конструирование протеолипосом, содержащих мембранные белки. В данной работе нами на примере белковых партнёров CYP3A4 и CYB5A было проведено сравнение двух подходов создания протеолипосом для SPR-анализа межмолекулярных взаимодействий мембранных белков: встраивание мембранного белка в липосомы, насыщенные детергентом, и встраивание мембранного белка в формирующиеся протеолипосомы по механизму мицеллярной коалесценции. SPR-анализ показал взаимодействие CYP3A4 с протеолипосомами, полученными методом встраивания CYB5A в липосомы, насыщенные детергентом. Факт взаимодействия между CYP3A4 и полученными методом мицеллярной коалесценции протеолипосомами, содержащими CYB5A, зафиксировать не удалось. Полученные результаты показали, что встраивание мембранного белка в липосомы, насыщенные детергентом, является более предпочтительным методом для работы с SPR-биосенсором по сравнению с методом формирования протеолипосом мицеллярной коалесценцией. Приведенные подробные протоколы создания протеолипосом и SPR-анализа могут быть полезны широкому кругу исследователей