Expression of human beta-defensins-1–4 in thyroid cancer cells and new insight on biologic activity of hBD-2 in vitro

The study was aimed on analysis of human beta-defensin-1–4 (hBDs) mRNA expression in cultured thyroid cancer cells and evaluation of effects of recombinant hBD-2 (rec-hBD-2) on growth patterns, migration properties and expression of E-cadherin and vimentin in these cells. Methods: The study was performed on cultured follicular thyroid cancer WRO cells, papillary thyroid cancer TPC1 cells, and anaplastic thyroid cancer KTC-2 cells. For analysis of hBD-1–4 mRNA expression in thyroid cancer cells, semiquantitative RT-PCR was used. Effects of rec-hBD-2 on cell proliferation, viability, and migration were analyzed using direct cell counting, MTT test, and scratch assay respectively. Expression of vimentin and E-cadherin was evaluated by quantitative PCR (qPCR). Results: By the data of RT-PCR, all three studied thyroid cancer cell lines express hBD-1 and -4 mRNA, but not hBD-2 mRNA, while hBD-3 expression was detected in WRO and KTC-2 cells. The treatment of TPC-1, WRO, and KTC-2 cells with 100–1000 nM rec-hBD-2 resulted in significant concentration-dependent suppression of cell proliferation, viability, and migratory property. By the data of qPCR, significant up-regulation of vimentin expression was registered in KTC-2 and WRO cells treated with 500 nM rec-hBD-2. Significant down-regulation of E-cadherin expression (p < 0.05) was detected only in KTC-2 cells treated with the defensin. Also, it has been shown that TPC-1 cells treated with 500 nM rec-hBD-2 acquired more elongated morphology. Conclusion: The data demonstrate that hBD-2 in concentrations higher than 100 nM exerts significant concentration-dependent suppression of thyroid cancer cell growth and migration, and affects vimentin and E-cadherin expression dependent on histologic type of thyroid cancer cells. Key Words: thyroid cancer, human beta-defensin-2, E-cadherin, vimentin, proliferation, viability

Expression of cancer-associated genes in prostate tumors at mRNA and protein levels

Aim. To analyze an expression pattern of the cancer-associated genes in prostate tumors at mRNA and protein levels and find putative association between the expression of these genes and the genes, controlling epithelial to mesenchymal cell transition (EMT), the markers of prostate cancer and stromal elements. Methods. Relative expression of genes was assessed by a quantitative PCR in 29 prostate cancer tissue samples (T) of different Gleason score (GS) and tumor stage, 29 paired conventionally normal prostate tissue (CNT) samples and in 14 samples of prostate adenomas (A). Immunohistochemistry (IHC) was used to assess protein expression. Results. We found significant differences (p<0.05) in RE of three genes (FOS, PLAU, EPDR1) between the T, N and A groups. FOS was induced in T and CNT, compared with A whereas PLAU and EPDR1 were decreased. Noteworthy, RE of the five genes (FOS, EFNA5, TAGLN, PLAU and EPDR1) changed significantly, depending on GS (p<0.05) in T, compared to the A and/or CNT groups. Moreover, according to the K-means clustering, RE of the FOS, PLAU and EDPR1 genes varied in the tumor groups, consisting of cancers with different GS. The FOS protein signal was higher in adenocarcinomas, compared to hyperplasia. The same trend was demonstrated by q-PCR. FOS expression increased upon the tumor development i.e. was higher in the tumors at stage 3-4. PLAU expression was decreasing meanwhile, as was shown by q-PCR and IHC. Conclusions. IHC data allowed us to understand the high levels of RE dispersion. Mainly, it is due to the expression in other cell types, and not in the prostate gland cells. For the meaningful clustering, prognosis and also for the creation of specific biomarker panels, these two methods should be adequately merged.Мета. Проаналізувати патерни експресії пухлино-асоційованих генів на рівнях мРНК та протеїнів та вивчити можливу асоціацію між експресією цих генів та генів, що контролюють епітеліально-мезенхимальний перехід, маркерів раку передміхурової залози та стромальних елементів. Методи. Відносні рівні експресії (ВЕ) генів були встановлені за допомогою кількісної ПЛР (кПЛР) у 29 зразках аденокарцином передміхурової залози (П) з різними ступенями Глісона (СГ) та стадіями захворювання, 29 парних умовно-нормальних тканин передміхурової залози (Н) та 14 зразках аденом (А). Імуногістохімія (ІГХ) була використана для встановлення рівнів експресії протеїнів. Результати. Виявлено значні відмінності ВЕ (p<0.05) для трьох генів (FOS, PLAU, EPDR1) між групами П, Н та А. FOS має підвищені рівні ВЕ у групах П та Н у порівнянні з А, тоді як PLAU та EPDR1 навпаки знижені рівні ВЕ у цих групах. Примітно, що п’ять генів (FOS, EFNA5, TAGLN, PLAU та EPDR1) мають зміни ВЕ в залежності від СГ у П у порівнянні з А та/або Н. Крім того, згідно кластеризації за методом К-центрів FOS, PLAU та EDPR1 мають різноманітні рінві ВЕ у групах аденокарцином з різними СГ. Білок FOS має підвищений сигнал у аденокарциномах у порівнянні з аденомами. Ті ж зміни продемонстровані й кПЛР. Експресія FOS підвищується при розвитку пухлин, тобто, вона є вищою у пухлинах з 3-4 стадією. Експресія PLAU навпаки знижується, як було показано кПЛР та ІГХ методами. Висновки. Дані IГХ дозволили зрозуміти високий рівень дисперсії ВЕ. В основному це пов'язано з експресією генів у інших типах клітин, а не тільки в клітинах передміхурової залози. Для успішної кластеризації, потенційного прогнозу та створення специфічних панелей біомаркерів ці два методи повинні бути адекватно об'єднані.Цель. Проанализировать паттерны экспрессии опухоль-ассоциированных генов на уровнях мРНК и белка и исследовать возможную ассоциацию между экспрессией этих генов и генов, которые контролируют эпителиально-мезенхимальных переход, маркеров рака простаты и стромальных элементов. Методы. Уровни относительной экспрессии (ОЭ) генов были установлены с помощью количественной ПЦР (кПЦР) в 29 образцах аденокарцином простаты (О) с различными степенями Глиссона (СГ) и стадиями заболевания, 29 парных условно-нормальных тканей простаты (Н) и 14 образцах аденом (А). Иммуногистохимия (ИГХ) была использована для установления уровней экспрессии белков. Результаты. Обнаружены значимые отличия ОЭ (p<0.05) для трех генов (FOS, PLAU, EPDR1) между группами О, Н и А. Для гена FOS выявлены повышенные урони ОЭ в группах О и Н по сравнению с А, тогда как для PLAU и EPDR1 наоборот обнаружены сниженные урони ОЭ в этих группах. Следует отметить, что пять генов (FOS, EFNA5, TAGLN, PLAU та EPDR1) имеют отличия ОЭ в зависимости от СГ в О по сравнению с А и/или Н. Кроме того, согласно данным кластеризации по методу К-центров FOS, PLAU та EDPR1 имеют различные ОЭ в группах аденокарцином с разными СГ. Белок FOS имеет повышение сигнала в аденокарциномах по сравнению с аденомами. Такие же изменения показал и кПЦР анализ. Экспрессия FOS повышается в процессе развития опухолей простаты, то есть она выше в опухолях 3-4 стадии. Экспрессия PLAU наоборот снижается, как было показано кПЦР и ИГХ методами. Выводы. Данные ИГХ позволили понять причину высокой дисперсии ОЭ. В основном это связано с наличием экспрессии генов в разных типах клеток, а не только в клетках простаты. Для успешной кластеризации, потенциального прогноза и создания специфических панелей биомаркеров эти два метода должны быть адекватно объединены для анализа

Biologic activities of recombinant human-beta-defensin-4 toward cultured human cancer cells

Aim - the aim of the study was in vitro analysis of biological activity of recombinant human beta-defensin-4 (rec-hBD-4). Methods: hBD-4 cDNA was cloned into pGEX-2T vector, and recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21(DE3) cells. To purify soluble fusion GST-hBD-4 protein, affinity chromatography was applied. Rec-hBD-4 was cleaved from the fusion protein with thrombin, and purified by reverse phase chromatography on Sep-Pack C18. Effects of rec-hBD-4 on proliferation, viability, cell cycle distribution, substrate-independent growth, and mobility of cultured human cancer cells of A431, A549, and TPC-1 lines were analyzed by direct cell counting technique, MTT assay, flow cytofluorometry, colony forming assay in semi-soft medium, and wound healing assay. Rech-BD-4 was expressed in bacterial cells as GST-hBD-4 fusion protein, and purified by routine 3-step procedure (affine chromatography on glutathione-agarose, cleavage of fusion protein by thrombin, and reverse phase chromatography). Analysis of in vitro activity of rec-hBD-4 toward three human cancer cell lines has demonstrated that the defensin is capable to affect cell behaviour in concentration-dependent manner. In 1 - 100 nM concentrations rec-hBD-4 significantly stimulates cancer cell proliferation and viability, and promotes cell cycle progression through G2/M checkpoint, greatly enhances colony-forming activity and mobility of the cells. Treatment of the cells with 500 nM of rec-hBD-4 resulted in opposite effects: significant suppression of cell proliferation and viability, blockage of cell cycle in G1/S checkpoint, significant inhibition of cell migration and colony forming activity