Интернализация рекомбинантной имиглюцеразы в перитонеальные макрофаги мыши и фибробласты мыши линии L929

Enzyme replacement therapy (ERT) is one of the most efficient treatments for lysosomal storage diseases. Type 1 Gaucher disease is caused by β-glucocerebrosidase enzyme deficiency, which may be compensated for by intravenous infusions of imiglucerase—a recombinant enzyme. Imiglucerase targets macrophages and enters these cells via interaction with mannose receptors on the cell membrane. Characterisation of internalization of enzymes by target cells is important in the context of the development of new medicines and production of existing ERT medicines. The peritoneal and alveolar macrophages, as well as macrophages of the spleen of small laboratory animals (rats and mice) are widely used in such studies. However, isolation of cells from animal sources raises ethical issues, and therefore continuous mammalian cell lines may offer an attractive alternative. The aim of the study: to conduct comparative studies on the internalization of recombinant imiglucerase into mouse peritoneal macrophages and L929 mouse fibroblasts. Materials and methods: CerezymeR batches 7HV0913, C6214H05, 7HV0888 (Genzyme Ltd., UK); Glurazim batches 020416, 011117, 021117 (LLC “IBC “Generium”, Russia). We used peritoneal macrophages obtained from BALB/c mice and L929 mouse fibroblasts. The cells were cultured in DMEM/F12 complete growth medium with 10% fetal bovine serum. The activity of imiglucerase internalized into the cells was evaluated spectrophotometrically by hydrolysis of the artificial substrate—4-methylumbelliferyl-β-Dglucopyranoside. Results: the study compared internalization of recombinant imiglucerase (the active ingredient of CerezymeR and Glurazim) by mouse peritoneal macrophages and L929 mouse fibroblasts. It was demonstrated that the medicines activity in the lysates of peritoneal macrophages is comparable with that in the lysates of L929 mouse fibroblasts. Regardless of the model system, the activity of Glurazim stayed within the acceptable range (80–125%) established for biosimilar products. Conclusions: the experiments proved that L929 mouse fibroblasts could be recommended for assessment of internalization of recombinant imiglucerase.Фермент-заместительная терапия (ФЗТ) является одной из самых действенных при лечении болезней лизосомального накопления. Болезнь Гоше первого типа характеризуется недостатком нативного фермента β-глюкоцереброзидазы, который возмещают внутривенными инфузиями рекомбинантного фермента (имиглюцераза). Клетками-мишенями имиглюцеразы являются макрофаги, в которые фермент проникает посредством взаимодействия с рецепторами маннозы на клеточной мембране. Оценка интернализации ферментов клетками-мишенями представляет интерес при разработке новых и воспроизведении существующих препаратов для ФЗТ. Для этих исследований широко применяются перитонеальные и альвеолярные макрофаги, макрофаги селезенки мелких лабораторных животных (крыс и мышей). Однако получение таких клеток затрагивает этические вопросы использования лабораторных животных. Альтернативой являются перевиваемые клеточные линии млекопитающих. Цель работы: провести сравнительные исследования интернализации рекомбинантной имиглюцеразы в перитонеальные макрофаги мыши и фибробласты мыши линии L929. Материалы и методы: Церезим®, серии 7HV0913, C6214H05, 7HV0888 (Джензайм Лтд., Великобритания); Глуразим, серии 020416, 011117, 021117 (ООО «МБЦ «Генериум», Россия). В работе использовали перитонеальные макрофаги, полученные от мышей линии BALB/c, и фибробласты мыши линии L929. Клетки культивировали в полной ростовой среде ДМЕМ/Ф12 c добавлением 10% сыворотки плода крупного рогатого скота. Активность имиглюцеразы, проникшей в клетки, оценивали спектрофотометрически по гидролизу искусственного субстрата 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкопиранозида. Результаты: представлены данные сравнительной оценки интернализации рекомбинантной имиглюцеразы, действующего вещества препаратов Церезим® и Глуразим, перитонеальными макрофагами мыши и клетками фибробластов мыши линии L929. Показано, что активность препаратов в лизатах перитонеальных макрофагов сопоставима с их активностью в лизатах клеток фибробластов мыши линии L929, при этом активность разработанного препарата Глуразим независимо от типа клеток, была в границах допустимого диапазона (80–125%), установленного для биоподобных препаратов. Выводы: экспериментально доказано, что фибробласты мыши линии L929 могут быть рекомендованы для оценки интернализации рекомбинантной имиглюцеразы

Assessment of T-cell immunity to SARS-CoV-2 in COVID-19 convalescents and vaccinated subjects, using TigraTest^® SARS-CoV-2 ELISPOT kit

With the onset of the COVID-19 pandemic, a number of molecular-based tests have been developed to diagnose SARS-CoV-2 infection. However, numerous available serological tests lack sufficient sensitivity or specificity. They do not detect specific antibodies in a significant proportion of patients with PCR-confirmed COVID-19. There is evidence that some convalescents have a relatively short-lived humoral immunity. In contrast, a number of publications have shown that T-cell response to human coronaviruses, including SARS-CoV-1, MERS, and SARS-CoV-2, can be strong and long-term. Assessment of T-cell immunity to SARS-CoV-2 is important not only for stratification of risks and identification of potentially protected populations with immunity acquired as a result of previous infection, but also for determining immunogenicity and potential efficacy of vaccines under development. The existing methods of quantitative or semi-quantitative assessment of specific T-cell response are mainly used in scientific research and are not standardised. The aim of the study was to develop and verify experimentally a test kit to be used in a standardised procedure for in vitro determination of T-cells specific to SARS-CoV-2 antigens, in human peripheral blood. Materials and methods: the TigraTest® SARS-CoV-2 kit developed by GENERIUM, which determines the number of T-cells secreting interferon gamma in vitro, was tested in the study. Samples of venous blood of volunteers from three different groups were analysed in the study: presumably healthy volunteers; COVID-19 convalescents; individuals vaccinated against SARS-CoV-2. Results: the authors developed the TigraTest® SARS-CoV-2 kit for in vitro determination of T-cells specific to SARS-CoV-2 antigens in human peripheral blood, demonstrated its specificity and performed preliminary assessment of its sensitivity. The study analysed the range and magnitude of the T-cell response in convalescent and vaccinated individuals. A pronounced T-cell response was also shown in some individuals with no symptoms or with unconfirmed diagnosis. It was discovered that the mean T-cell response to peptides of the spike protein (S-protein) was higher in the vaccinated individuals than in the convalescent patients. A correlation was determined between the severity of the disease and the level of T-cell response. Specific contributions of various groups of antigens to the T-cell response after COVID-19 infection were also determined. Conclusions: the TigraTest® SARS-CoV-2 kit is a specific and sensitive tool for the assessment of T-cell immunity to the SARS-CoV-2 virus, which can also be used for vaccinated individuals. The kit may be used in clinical practice for comprehensive assessment of immunity to SARS-CoV-2

Internalization of Recombinant Imiglucerase into Mouse Peritoneal Macrophages and L929 Mouse Fibroblasts

Enzyme replacement therapy (ERT) is one of the most efficient treatments for lysosomal storage diseases. Type 1 Gaucher disease is caused by β-glucocerebrosidase enzyme deficiency, which may be compensated for by intravenous infusions of imiglucerase—a recombinant enzyme. Imiglucerase targets macrophages and enters these cells via interaction with mannose receptors on the cell membrane. Characterisation of internalization of enzymes by target cells is important in the context of the development of new medicines and production of existing ERT medicines. The peritoneal and alveolar macrophages, as well as macrophages of the spleen of small laboratory animals (rats and mice) are widely used in such studies. However, isolation of cells from animal sources raises ethical issues, and therefore continuous mammalian cell lines may offer an attractive alternative. The aim of the study: to conduct comparative studies on the internalization of recombinant imiglucerase into mouse peritoneal macrophages and L929 mouse fibroblasts. Materials and methods: CerezymeR batches 7HV0913, C6214H05, 7HV0888 (Genzyme Ltd., UK); Glurazim batches 020416, 011117, 021117 (LLC “IBC “Generium”, Russia). We used peritoneal macrophages obtained from BALB/c mice and L929 mouse fibroblasts. The cells were cultured in DMEM/F12 complete growth medium with 10% fetal bovine serum. The activity of imiglucerase internalized into the cells was evaluated spectrophotometrically by hydrolysis of the artificial substrate—4-methylumbelliferyl-β-Dglucopyranoside. Results: the study compared internalization of recombinant imiglucerase (the active ingredient of CerezymeR and Glurazim) by mouse peritoneal macrophages and L929 mouse fibroblasts. It was demonstrated that the medicines activity in the lysates of peritoneal macrophages is comparable with that in the lysates of L929 mouse fibroblasts. Regardless of the model system, the activity of Glurazim stayed within the acceptable range (80–125%) established for biosimilar products. Conclusions: the experiments proved that L929 mouse fibroblasts could be recommended for assessment of internalization of recombinant imiglucerase

Оценка Т-клеточного иммунитета к SARS-CoV-2 у переболевших и вакцинированных против COVID-19 лиц с помощью ELISPOT набора ТиграТест® SARS-CoV-2

With the onset of the COVID-19 pandemic, a number of molecular-based tests have been developed to diagnose SARS-CoV-2 infection. However, numerous available serological tests lack sufficient sensitivity or specificity. They do not detect specific antibodies in a significant proportion of patients with PCR-confirmed COVID-19. There is evidence that some convalescents have a relatively short-lived humoral immunity. In contrast, a number of publications have shown that T-cell response to human coronaviruses, including SARS-CoV-1, MERS, and SARS-CoV-2, can be strong and long-term. Assessment of T-cell immunity to SARS-CoV-2 is important not only for stratification of risks and identification of potentially protected populations with immunity acquired as a result of previous infection, but also for determining immunogenicity and potential efficacy of vaccines under development. The existing methods of quantitative or semi-quantitative assessment of specific T-cell response are mainly used in scientific research and are not standardised. The aim of the study was to develop and verify experimentally a test kit to be used in a standardised procedure for in vitro determination of T-cells specific to SARS-CoV-2 antigens, in human peripheral blood. Materials and methods: the TigraTest® SARS-CoV-2 kit developed by GENERIUM, which determines the number of T-cells secreting interferon gamma in vitro, was tested in the study. Samples of venous blood of volunteers from three different groups were analysed in the study: presumably healthy volunteers; COVID-19 convalescents; individuals vaccinated against SARS-CoV-2. Results: the authors developed the TigraTest® SARS-CoV-2 kit for in vitro determination of T-cells specific to SARS-CoV-2 antigens in human peripheral blood, demonstrated its specificity and performed preliminary assessment of its sensitivity. The study analysed the range and magnitude of the T-cell response in convalescent and vaccinated individuals. A pronounced T-cell response was also shown in some individuals with no symptoms or with unconfirmed diagnosis. It was discovered that the mean T-cell response to peptides of the spike protein (S-protein) was higher in the vaccinated individuals than in the convalescent patients. A correlation was determined between the severity of the disease and the level of T-cell response. Specific contributions of various groups of antigens to the T-cell response after COVID-19 infection were also determined. Conclusions: the TigraTest® SARS-CoV-2 kit is a specific and sensitive tool for the assessment of T-cell immunity to the SARS-CoV-2 virus, which can also be used for vaccinated individuals. The kit may be used in clinical practice for comprehensive assessment of immunity to SARS-CoV-2.С началом пандемии COVID-19 в мире и Российской Федерации был разработан ряд молекулярно-биологических тестов для диагностики инфекции, вызванной SARS-CoV-2. Однако результаты применения многочисленных серологических тестов свидетельствуют об их недостаточной чувствительности или специфичности. У существенной части пациентов с подтвержденным ПЦР-диагнозом COVID-19 специфические антитела не обнаруживаются. Существуют доказательства того, что у части выздоровевших гуморальный иммунный ответ является относительно кратковременным. В ряде публикаций показано, что Т-клеточный ответ на человеческие коронавирусы, включая SARS-CoV-1, MERS и SARS-CoV-2, может быть сильным и долговременным. Оценка Т-клеточного иммунитета к SARS-CoV-2 важна не только для стратификации рисков и определения потенциально защищенных групп населения с иммунитетом, приобретенным вследствие перенесенной инфекции, но и для определения иммуногенности и потенциальной эффективности разрабатываемых вакцин. Существующие методики количественной или полуколичественной оценки специфического Т-клеточного ответа применяются в основном в научных исследованиях и не стандартизованы. Цель работы: разработка и апробация тест-системы для выполнения стандартизованной методики определения специфических к антигенам SARS-CoV-2 Т-клеток в периферической крови человека in vitro. Материалы и методы: разработанный компанией «ГЕНЕРИУМ» набор ТиграТест® SARS-CoV-2, принцип работы которого заключается в определении количества Т-клеток, секретирующих гамма-интерферон in vitro. Исследования проводили на образцах венозной крови добровольцев трех групп: условно здоровых, переболевших COVID-19, прошедших вакцинацию против COVID-19. Результаты: разработана тест-система для определения специфических к антигенам SARS-CoV-2 Т-клеток в периферической крови человека in vitro. Показана специфичность и определена предварительная чувствительность теста ТиграТест® SARS-CoV-2. Исследован диапазон и величина Т-клеточного ответа у переболевших и вакцинированных. Показан выраженный Т-клеточный ответ и у части лиц с отсутствующими симптомами или неподтвержденным диагнозом. Обнаружено, что среднее значение Т-клеточного ответа в отношении пептидов белка-шипа (S-белка) выше у вакцинированных, чем у переболевших. Найдена корреляция между тяжестью заболевания и уровнем Т-клеточного ответа. Определен удельный вклад различных групп антигенов в Т-клеточный ответ после перенесенного заболевания COVID-19. Выводы: набор ТиграТест® SARS-CoV-2 является специфичным и чувствительным инструментом в оценке Т-клеточного иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, в том числе и для вакцинированных. Разработанный набор целесообразно использовать в клинической практике для комплексной оценки иммунитета к SARS-CoV-2